【新手指南】细胞实验系列（一）：细胞培养、原代细胞分离与鉴定、细胞株构建

01 细胞的三种生长类型

按照生长附着依赖特性，体外培养细胞可分为三类：

• 贴壁细胞（Adherent cell）：依赖支持物表面附着生长，大多数实体组织来源的细胞（如肿瘤细胞、成纤维细胞、上皮细胞）均为此类型。正常二倍体细胞通常具有接触抑制特性，肿瘤转化细胞则常丧失接触抑制，可多层堆叠生长。细胞生长至适宜汇合度后需定期传代稀释。

• 悬浮细胞（Suspension cell）：无需附着支持物，可在培养基中悬浮生长，常见于血液系统来源的细胞（如淋巴细胞、白血病细胞）。悬浮细胞传代无需消化，直接稀释或离心换液即可，适合大规模扩增。

• 半贴壁半悬浮细胞（Semi-adherent cell）：同时具备贴壁与悬浮生长特性，部分细胞附着于培养器皿表面，部分悬浮于培养基中，如部分巨噬细胞、淋巴瘤细胞系。培养时需结合两种细胞的操作特点，传代可先收集悬浮细胞，再对贴壁部分进行温和消化，合并接种以保证细胞回收率。

02 核心培养条件

细胞体外存活依赖严格的环境调控，核心参数包括：

• 无菌环境：所有操作与耗材需严格灭菌，避免细菌、真菌、支原体等微生物污染。细菌、真菌污染通常发展迅速，可通过培养基浑浊、镜下病原体形态快速识别；支原体污染无明显肉眼特征，可改变细胞代谢、基因表达与药物敏感性，是影响实验重复性的首要隐性因素，需定期专项检测²。

• 温度与气相：哺乳动物细胞常规培养温度为37℃，搭配5% CO₂气体环境，通过碳酸氢钠缓冲体系维持培养基pH稳定。

• 营养体系：细胞培养基按用途与成分可分为基础培养基、完全培养基与无血清培养基三类。常用基础培养基包括MEM、DMEM（高糖/低糖型）、RPMI-1640、F-12等，可适配不同细胞类型；完全培养基由基础培养基添加血清、双抗等组成；无血清培养基通过添加已知组分替代血清，适合特定研究场景³。

• pH与渗透压：哺乳动物细胞适宜pH为7.2-7.4，酚红作为pH指示剂，酸性条件下呈黄色，碱性条件下呈紫色，中性7.2-7.4时呈樱桃红色；适宜渗透压范围为260-320 mOsm/kg，人源细胞理想渗透压约290 mOsm/kg。

03 核心操作与质量控制

复苏、传代与冻存是细胞培养的三大基础操作，核心遵循“慢冻速融”原则，以最大限度维持细胞活力与功能完整性：

• 细胞复苏：37℃水浴快速融化冻存细胞，稀释后离心去除冻存保护剂二甲基亚砜（DMSO），接种培养。快速升温可避免细胞内形成大冰晶，减少机械损伤与高渗应激⁴。

• 细胞传代：贴壁细胞经胰蛋白酶-EDTA消化解离后，按比例分装传代；悬浮细胞可直接稀释或离心换液传代。贴壁细胞传代的最佳时机为对数生长期、汇合度达80%-90%时，避免过度汇合导致细胞状态改变。

• 细胞冻存：采用含DMSO的冻存液重悬细胞，通过程序降温（4℃静置→-80℃过夜→液氮长期保存）缓慢冷冻，使细胞逐步脱水，减少冰晶形成。细胞长期储存推荐置于液氮气相层（-190℃左右），理论上可一直保存；-80℃仅适合短期储存，长期存放会导致细胞活力持续下降⁴。

01 通用分离流程

不同组织原代细胞的分离细节存在差异，但核心流程一致，全程需严格控制无菌与低温，程度保留细胞活性：

1）组织取材预处理：无菌条件下取目标组织，去除结缔组织与坏死区域，预冷缓冲液漂洗；

2）机械解离与酶消化：将组织剪碎后，选用胰蛋白酶、胶原酶等适宜的蛋白酶消化，获得单细胞悬液；

02 关键质控与避坑要点

原代细胞培养难度高、变量多，需重点把控以下环节：

• 离体时效控制：组织离体后缺血缺氧会快速诱导应激基因表达与细胞凋亡，推荐“试剂等样本”而非“样本等试剂”，即所有耗材、试剂、培养器皿提前准备就绪后再进行取材操作；暂无法处理的组织需置于4℃组织保存液中低代谢待机。

• 消化条件优化：酶消化效率受组织类型、动物年龄、酶活性、组织块大小等影响，不可盲目照搬文献时间。建议设置梯度预实验，确定最佳消化窗口，兼顾活率与单细胞产率。

• 杂细胞污染防控：原代培养易混入成纤维细胞，其增殖快、竞争性强，差速贴壁法利用其贴壁更快的特点，接种后30-60 min吸取上清重新接种，可有效去除大部分成纤维细胞，也可结合条件培养基筛选、机械刮除等方式纯化，避免目标细胞被挤占。

• 代次限制：随着传代次数增加，原代细胞会逐渐发生表型漂移，丢失体内原始特性，多数原代细胞超过P5代后转录组与功能会发生显著偏移，建议在P3代前完成核心功能验证。

03 原代细胞鉴定标准

分离后的原代细胞需通过多维度验证：

• 形态学鉴定：显微镜下观察细胞特征性形态，如神经元的轴突树突、心肌细胞的梭形结构与自律搏动；

• 免疫荧光（IF）鉴定：通过细胞特异性标志物染色验证纯度，如神经元用β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulin Ⅲ）、心肌细胞用α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）；

• 功能验证：检测细胞特有生理功能，确保功能完整性。

图4. 原代细胞分离与鉴定

A：原代小鼠心肌细胞（α-SMA免疫荧光鉴定）；B：原代胎鼠海马神经元细胞（β-tubulin免疫荧光鉴定）

01 稳转细胞株（Stable cell line）

稳转细胞株是指通过基因转移技术将外源基因导入宿主细胞，使其整合至基因组或以游离体形式稳定存在，可在多次传代中持续维持基因表达的细胞株。与瞬时转染相比，稳转株表达均一、批次差异小，适用于长期基因功能研究、高通量筛选与重组蛋白表达⁷。

• 构建流程：载体构建→基因导入（慢病毒（LV）转导、化学转染等）→药物筛选获得多克隆群→单克隆化与表达验证。LV载体因可高效感染分裂与非分裂细胞、整合效率高，是目前构建稳转株的主流工具。

• 核心分类：按细胞类型分为贴壁细胞稳转株与悬浮细胞稳转株，悬浮细胞转染难度更高，常需病毒介导；按纯化程度分为多克隆稳转株（构建快、成本低，适合初步验证）与单克隆稳转株（遗传背景均一，适合精确定量实验）。

02 耐药细胞株（Drug-resistant cell line）

耐药细胞株是通过药物诱导或基因编辑获得的、对特定药物具有耐药性的细胞模型，是研究肿瘤耐药机制、筛选耐药逆转剂的核心工具⁸。

• 常用构建方法：①药物浓度递增法：从低浓度开始逐步提高药物剂量，持续诱导数周至数月，最接近临床获得性耐药的产生过程；②间歇冲击法：高浓度药物短时间处理与无药恢复期交替，诱导速度快于浓度递增法；③基因编辑法：通过CRISPR/Cas9等技术直接引入已知耐药突变，快速获得基因型明确的耐药模型。

• 耐药性验证：通过细胞活力实验计算半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration,IC₅₀）与耐药指数（Resistance index,RI），RI=耐药株IC₅₀/亲本细胞IC₅₀，RI＞5常作为体外模型判定稳定耐药的经验阈值；同时需验证耐药相关标志物表达、细胞周期与凋亡表型等生物学特征。

图5.梯度剂量递增构建奥拉帕利药物适应细胞群体

a：梯度剂量递增造模实验设计与细胞形态；b：不同药物适应细胞群体的奥拉帕利剂量-反应曲线（França, Gustavo S et al., Nature, 2024.）

[1] Segeritz C-P, Vallier L. Cell Culture: Growing Cells as Model Systems In Vitro. In: Basic Science Methods for Clinical Researchers. Academic Press/Elsevier, 2017: 151-172. DOI: 10.1016/B978-0-12-803077-6.00009-6；无 PMID（PMCID: PMC7149418）

[2]Uphoff CC, Drexler HG. Detection of Mycoplasma contamination in cell cultures. Curr Protoc Mol Biol. 2014;106:28.4.1–28.4.14. DOI: 10.1002/0471142727.mb2804s106；PMID: 24733240

[3]van der Valk J, Brunner D, De Smet K, et al. Optimization of chemically defined cell culture media – replacing fetal bovine serum in mammalian in vitro methods. Toxicol In Vitro. 2010;24(4):1053-1063. DOI: 10.1016/j.tiv.2010.03.016；PMID: 20362047

[4]Hunt CJ. Cryopreservation: Vitrification and Controlled Rate Cooling. Methods Mol Biol. 2017;1590:41-77. DOI: 10.1007/978-1-4939-6921-0_5；PMID: 28353262

[5] Masters JR. Cell line misidentification: the beginning of the end. Nat Rev Cancer. 2010;10(6):441–448. DOI: 10.1038/nrc2852；PMID: 20448633

[6]Harper JM. Primary Cell Culture as a Model System for Evolutionary Molecular Physiology. Int J Mol Sci. 2024;25(14):7905. DOI: 10.3390/ijms25147905；PMID: 39063147

[7] Tandon N, Thakkar KN, LaGory EL, Liu Y, Giaccia AJ. Generation of Stable Expression Mammalian Cell Lines Using Lentivirus. Bio Protoc. 2018;8(21):e3073. DOI: 10.21769/BioProtoc.3073；PMID: 30505888

[8] Kadomoto S, Shelley G, Mizokami A, Keller ET. Development of Drug-resistant Cell Lines for Experimental Procedures. J Vis Exp. 2025;(222):e68957. DOI: 10.3791/68957；PMID: 40889269