【客户文章】Mol Psychiatry︱新突破！空军军医大学张西京/尹路团队揭示慢性应激加重脓毒症的“脑-免疫”调控新机制

研究首先建立慢性束缚应激（CRS）复合LPS诱导的脓毒症模型。与单纯LPS组相比，CRS+LPS组生存率进一步下降；LPS组与CRS+LPS组体重均显著低于对照组，但CRS+LPS与LPS组间体重恢复无显著差异。上述结果提示，慢性应激可进一步加重脓毒症生存损害。进一步检测外周炎症介质发现，LPS诱导IL-1β、CCL-2、CCL-5及TNF-α等多种炎症因子明显升高；与单纯LPS相比，CRS+LPS组CCL-5在6、12、24 h多个时间点持续显著升高，而IL-1β和TNF-α在两组间无显著差异，提示慢性应激主要选择性放大CCL-5相关炎症反应，而非全面升高经典促炎因子。上述结果表明，慢性应激可扰乱脓毒症炎症反应的动态平衡，并最终加重疾病严重程度。

图1 慢性应激可显著加重LPS诱导的脓毒症样炎症反应和生存损害

为明确迷走神经背侧运动核（DMV）在脓毒症免疫调控中的作用，研究采用化学遗传学技术双向调控DMV胆碱能神经元，并通过流式细胞术系统分析脾脏T细胞亚群变化。结果显示，LPS可引起Th1、Th2、Th17、细胞毒性T细胞（CTL）及调节性T细胞（Treg）等多个亚群发生明显改变，而慢性应激进一步造成Th1、Th2及Treg等适应性免疫细胞减少，呈现更加显著的免疫失衡。激活DMV胆碱能神经元能够不同程度纠正上述异常，特别是促进Treg等具有免疫调节作用的细胞恢复；相反，抑制DMV胆碱能神经元则削弱这一调节效应。提示DMV胆碱能神经元是连接中枢神经活动与脾脏免疫稳态的重要调控节点。

图2 慢性应激进一步加重脓毒症诱导的适应性免疫失调，DMV胆碱能神经元参与其调控

为进一步探究慢性应激影响脓毒症的中枢神经机制，研究采用全细胞膜片钳技术分别记录mPFC谷氨酸能神经元和DMV胆碱能神经元的内在兴奋性及突触活动。结果显示，LPS与CRS+LPS均改变mPFC谷氨酸能及DMV胆碱能神经元电生理特征；CRS+LPS中mPFC谷氨酸能神经元兴奋性进一步降低；DMV胆碱能神经元在LPS中放电减少，但CRS+LPS未进一步减少；LPS与CRS+LPS中DMV胆碱能神经元自发性兴奋性突触后电流（sEPSC）振幅升高、频率不变。进一步通过化学遗传学激活相关神经元后，异常的突触活动得到不同程度纠正。上述结果提示，慢性应激并非仅改变外周炎症，而是能够在中枢层面重塑mPFC-DMV神经环路的功能状态，为后续寻找连接中枢与外周免疫的功能通路提供了依据。

图3 慢性应激与脓毒症显著重塑DMV^ChAT及mPFC^Glu神经元电生理活动，化学遗传学激活可改善异常突触传递

为验证mPFC-DMV中枢环路能否进一步影响外周自主神经功能，研究采用化学遗传学结合在体脾神经电生理记录，连续监测不同疾病及干预状态下的脾神经放电。结果显示，LPS与CRS+LPS组脾神经放电频率均显著低于对照组，但LPS与CRS+LPS两组间无显著差异；即慢性应激复合脓毒症状态下脾神经活动同样受抑，但未见较单纯LPS进一步降低。激活DMV胆碱能神经元能够恢复部分脾神经活动，而选择性激活投射至DMV的mPFC谷氨酸能神经元同样显著提高脾神经放电。该结果从功能电生理层面建立了“mPFC-DMV中枢神经环路—外周脾神经”之间的联系，为中枢神经系统通过自主神经调节脾脏免疫反应提供了直接证据。

图4 激活DMV^chat及mPFC^glu-DMV可显著改善应激复合脓毒症小鼠受抑制的脾神经电活动

除炎症和免疫改变外，研究进一步应用基于三维骨架重建和层级行为聚类的3D行为学技术，对小鼠自发活动进行精细分解。结果显示，LPS与CRS+LPS组活动轨迹范围均明显缩小，全身运动速度呈梯度下降；在所有检测的自发行为亚型中，蜷缩（curling）行为的组间差异幅度最大、统计学意义最明确，其余细分行为（包括理毛、奔跑等）均未检测到统计学意义的组间差异。激活DMV胆碱能神经元或mPFC-DMV谷氨酸能投射后，小鼠活动轨迹范围、整体运动速度均得到不同程度恢复，无监督聚类显示整体行为谱向正常对照状态偏移；其中蜷缩行为的减少具有明确统计学显著性，且直接激活DMV胆碱能神经元的改善效应强于mPFC-DMV投射激活。本研究首次将3D精细化行为分析体系应用于脓毒症及慢性应激复合脓毒症小鼠的复杂行为特征解析，并从整体动物表型层面进一步验证了mPFC-DMV神经环路干预的功能效应。

图5 前置应激因素可显著增加脓毒症小鼠的蜷缩行为，环路干预可逆转蜷缩异常并改善整体运动功能

进一步通过6-羟多巴胺（6-OHDA）进行外周化学性交感去神经干预后发现，该处理可显著削弱mPFC-DMV环路激活在CRS+LPS中的免疫保护作用，包括减弱环路对脾脏NE/ACh递质平衡、全身炎症因子水平及Treg细胞应答的调控作用，提示完整的脾脏交感神经免疫信号是mPFC-DMV环路发挥下游免疫调控功能的必要条件。

综上所述，本研究系统揭示了慢性应激加重脓毒症免疫失衡的中枢神经环路机制。研究发现，慢性应激可显著加重脓毒症炎症反应、免疫紊乱及整体疾病严重程度，其核心病理基础是慢性应激抑制了mPFC-DMV这一应激敏感神经环路的正常功能，进而伴随脾脏自主神经活动受抑、脾脏NE/ACh神经递质稳态失衡。通过化学遗传学激活DMV胆碱能神经元，或选择性激活投射至DMV的mPFC谷氨酸能神经元，可恢复脾脏自主神经输出，重建脾脏神经递质稳态，纠正外周免疫细胞失衡，并改善脓毒症相关的整体行为功能表型。

上述发现构建了由“mPFC-DMV中枢神经环路-脾自主神经-外周免疫”组成的功能性皮层-自主神经-免疫调控轴，为理解心理应激影响脓毒症发生发展的脑-免疫交互机制提供了新的实验依据，也为从神经调控角度探索脓毒症免疫失衡的潜在干预策略提供了新的理论基础。

图6 慢性应激加重脓毒症的mPFC-DMV-脾脏自主神经-免疫轴调控模型