病理性α-突触核蛋白的传播在非转基因小鼠中引发帕金森样神经退行性变

合成的α-Syn PFFs可在野生型（wt）小鼠原代神经元培养物中，高效诱导可溶性内源性α-Syn聚集与纤维化；基于此，本研究探讨了LB/LN病理能否在野生型小鼠体内发生传递。研究首先将重组小鼠α-Syn组装的PFFs，通过立体定位注射接种至年轻野生型（C57BL6/C3H）小鼠的背侧纹状体；背侧纹状体可摄取PFFs，且与中脑多巴胺神经元等多个中枢神经核团存在纤维连接。单次单侧接种PFF后30天内，注射位点即可观察到高磷酸化α-Syn（pSyn，人类LBs/LNs的标志物沉积（图1A、B、G）。在人类突触核蛋白病中出现路易小体的纹状体直接连接脑区，包括大脑皮层Ⅳ-Ⅴ层与嗅球，也出现神经元内α-Syn聚集，主要为弥散的类路易神经突与类路易小体包涵体（图1C、D），证实野生型小鼠的内源性α-Syn发生了病理性转化。注射后30天，除纹状体双侧投射的杏仁核外，pSyn阳性的类路易小体聚集仅出现在注射侧脑区，提示细胞间传递遵循神经元间的连接通路。

注射后90天与180天，受累脑区的LB/LN病理中pSyn免疫反应性显著增强（图1E、F、G）。对侧新皮层等更多脑区也出现LBs/LNs，提示病理向中枢神经系统进行性扩散（图1F-I）。对30、90、180天小鼠的pSyn病理分布图谱分析显示（图1G），30-180天内LBs/LNs呈时间依赖性扩散，原本30天未受累的腹侧纹状体、丘脑、枕叶皮层，以及连合纤维与脑干纤维，均相继出现病理改变。尽管海马、隔区、小脑等多个脑区未出现包涵体（图1G），但向海马立体定位接种等量PFFs后，该脑区出现大量α-Syn病理聚集，说明海马神经元同样对传递而来的病理性α-Syn易感。综上，LBs/LNs的扩散依赖神经连接，这也解释了α-Syn PFF诱导模型中LBs/LNs分布不均的现象。相比之下，注射单体α-Syn或PBS的小鼠，在所有观察时间点均未出现α-Syn病理改变（图1J）。

纹状体接种PFF后，向背侧纹状体中型多棘神经元投射的酪氨酸羟化酶（TH）阳性SNpc多巴胺神经元中，出现大量α-Syn病理改变（图1K、L）；而该类神经元的选择性退变正是PD运动障碍的主要诱因。此外，PFF接种小鼠的α-Syn病理与路易小体关键标志物（泛素、热休克蛋白90、淀粉样蛋白结合染料硫黄素S）存在共定位，说明该病理与人类PD中真实的LBs/LNs具有共同特征。

图1 纹状体内接种合成小鼠α-Syn预制纤维，诱导野生型小鼠内源性突触核蛋白聚集

PFF注射后，SNpc的α-Syn病理呈进行性发展：注射后30天表现为淡染的胞质聚集，90天与180天进展为核周致密的类路易小体包涵体，在腹内侧SNpc神经元中尤为明显（图2A-C）。由于黑质纹状体通路为单侧投射，所有观察时间点内，SNpc的LB/LN病理均局限于注射侧大脑半球（图1G、图2A-D）。除腹侧被盖区（VTA）神经元无病理改变外，表达多巴胺的嗅球小球中间神经元、下丘脑弓状核细胞也未出现α-Syn病理。同样，NA能神经元（蓝斑）与5-羟色胺能神经元（中缝核）在注射后180天也未受累，说明不同单胺能神经元对病理性α-Syn扩散的易感性存在差异。

SNpc出现α-突触核蛋白病理的同时，TH免疫反应性与神经元数量呈单侧渐进性下降（图2F-I），提示神经元内α-Syn包涵体可导致多巴胺神经元丢失。注射后30天，27.7%的SNpc多巴胺神经元与pSyn病理共定位（图2K）；此时两侧大脑半球的SNpc与VTA多巴胺神经元数量无显著差异（图2L、M）。仅SNpc多巴胺神经元形成LBs/LNs，VTA多巴胺神经元未受累，证实错误折叠的α-Syn通过神经网路投射传递，且神经连接是决定神经元易感性的关键因素。随时间推移，含包涵体的SNpc多巴胺神经元比例未持续上升，反而逐渐下降。注射后90天与180天，SNpc多巴胺神经元分别减少15%与35%，说明LBs/LNs形成早于SNpc多巴胺神经元丢失。此外，对侧SNpc与双侧VTA的多巴胺神经元（包涵体占比＜0.2%，图2K），与PBS注射组、单体注射组、同龄未注射组，以及PFF接种的Snca基因敲除小鼠的对应神经元无明显差异；上述对照组均未出现α-Syn沉积（图2D、K-M）。综上，病理性α-Syn的累积处于SNpc多巴胺神经元丢失的上游，且二者直接相关。

图2 种子化α-Syn病理诱导多巴胺系统进行性退变

伴随SNpc神经元进行性丢失，PFF接种后，注射侧纹状体内多巴胺及其代谢产物浓度进行性降低；对侧纹状体多巴胺水平无变化，双侧（NA）水平均未改变（图3A、B）。免疫印迹分析证实，注射侧纹状体的TH与多巴胺转运体（DAT）表达下调（图3C），与黑质纹状体多巴胺神经支配丢失的结果一致。尽管多巴胺神经末梢丢失，但D1、D2多巴胺受体水平保持稳定（图3C），说明纹状体中型多棘投射神经元未受破坏。

鉴于PFF接种的野生型小鼠出现类帕金森病的路易病理、SNpc神经元丢失与纹状体多巴胺水平下降，推测其会出现帕金森病样的运动功能改变。尽管注射后180天内未观察到明显的大体运动或行为异常，但转棒实验显示，PFF注射小鼠的运动表现呈进行性显著下降，提示其运动协调与平衡功能受损（图3D左）。此外，α-Syn病理小鼠的悬线实验表现不佳（该实验用于补充评估肌力与协调能力）；注射后30天与180天，小鼠成绩较基线分别下降53%与81%（图3D中）。但旷场实验中小鼠活动量无变化，说明其整体运动活跃度未受显著影响（图3D右）。

如前所述，纹状体内接种PFF的小鼠未出现海马病理改变（图1G），Y迷宫实验也未检测到记忆功能变化（图3E）。这一结果支持本研究的推论：神经元功能下降与受累神经元内α-Syn病理的加重相关。此外，与中脑边缘通路相对保留的特征一致，PFF处理组与对照组小鼠的悬尾实验（抑郁样行为检测）结果无显著差异（图3E右）。纹状体接种PFF的Snca杂合小鼠也呈现α-Syn病理与神经元损伤的相关性：注射后180天，其SNpc α-Syn病理与运动障碍程度均轻于野生型小鼠（图3D、E）。最后，向野生型CD1小鼠与C57BL6/SJL小鼠纹状体内接种PFF，同样可诱导α-Syn病理传递，说明LBs/LNs的细胞间扩散不依赖小鼠遗传背景。

图3 α-Syn PFF注射的野生型小鼠出现纹状体多巴胺水平下降与运动功能障碍