IF=14.7【新品推荐】纹状体神经元的精准靶向工具：增强子AAV工具箱的开发与跨物种验证

研究团队基于人和小鼠的bulk ATAC-seq开放染色质数据，在纹状体细胞标记基因附近筛选候选增强子序列，克隆到AAV载体中最小启动子（minBG，仅提供基础转录起点的中性启动子，不决定细胞特异性）和SYFP2荧光报告基因（SYFP2即超级黄色荧光蛋白2，绿光激发、黄光发射）的上游，用可穿透血脑屏障的PHP.eB衣壳包装后经眶后（RO，retro-orbitally，经眶后静脉窦的全身性静脉给药）注射入C57Bl6/J小鼠体内筛选。经过逐一筛选，最终确定了48个具有良好活性的增强子，其中包括20个pan-MSN增强子、5个D1 MSN增强子和7个D2 MSN增强子，其余靶向Sst-Chodl（生长抑素Sst⁺/软骨凝集素Chodl⁺的GABA能中间神经元）、Pvalb-Pthlh（小清蛋白Pvalb⁺/甲状旁腺激素样激素Pthlh⁺的GABA能中间神经元）和胆碱能（ChAT+）中间神经元。

表达强度主要取决于增强子活性，因此要提高表达强度，需要从增强子本身入手。为此，研究团队采用了增强子核心区串联策略——将增强子的核心区域多拷贝串联插入。结果表明，串联的增强子核心拷贝数与表达强度和标记完整度均呈正相关：以D1 MSN增强子AiE0779m为例，全长版（FL）、3倍核心串联版（3xC2）和6倍核心串联版（6xC2）的表达强度和标记完整度依次递增，三组之间两两比较的差异均有统计学意义。

图2 AiE0779m全长(FL)/3倍核心串联(3xC2)/6倍核心串联(6xC2)RNAscope信号强度与标记完整度对比

研究鉴定了两个各具特点的D1 MSN增强子：AiE0779m和AiE0780m。

AiE0779m是表现突出的D1增强子之一。其优化版AiE0779m_3xC2在多重验证中均达到极高特异性：免疫组化（IHC）达99%、单细胞RNA测序（scRNA-seq）达100%，多重荧光原位杂交（mFISH，RNAscope）略低，约为88%。在RO注射下，该增强子驱动的报告基因密集标记纹状体神经元，轴突投射至GPi和SNr，符合直接通路特征。

图3 各增强子经IHC/SSv4(scRNA-seq)/mFISH(RNAscope)三种方法的特异性定量对比

图4 MSN各亚群增强子表达模式概览

AiE0779m在RO、侧脑室ICV下均呈现清晰的D1 MSN靶向标记，立体定位（stereotaxic，STX）注射的荧光图像虽在GPe出现轴突样信号，但scRNA-seq证实其在RO与STX途径下对D1 MSN的特异性均为100%，提示该信号为D1 MSN的轴突侧支而非脱靶表达。

AiE0780m则呈现不同的表达特征：无论RO、ICV还是STX途径，都能实现清晰的D1 MSN特异性标记；但在表达强度上，RO注射时SYFP2信号较弱，STX注射下表达强健且高度特异。这说明不同增强子适配不同的实验场景，不存在一个"全能最优"的增强子。在南方猪尾猕猴实验中，正是选用了AiE0780m驱动SYFP2，经STX注射入尾状核Cd和壳核Put后，mFISH确认D1 MSN特异性分别为97%与95%，轴突末梢仅见于GPi和SNr，GPe中无标记（详见图8）。

这套工具不仅能精准标记神经元，还能操控神经元活动。研究将D1增强子AiE0779m_3xC2驱动的ChR2(CRC)-EYFP AAV经ICV注射入出生后第2天的幼鼠，待成年后在背侧纹状体植入光纤进行光遗传刺激：蓝光可稳定诱发D1-ChR2小鼠的运动加速和明显的对侧旋转，而仅表达SYFP2的对照小鼠无任何行为效应，证明增强子驱动的ChR2足以在体内操控神经元活动并改变行为。

AiE0452h是本研究的代表性D2 MSN增强子。与AiE0779m在STX注射下出现轴突样信号不同，AiE0452h在三种给药途径（RO、ICV、STX）下均保持稳定的高特异性，驱动的报告基因在纹状体中密集表达，轴突投射至GPe，符合间接通路特征。

研究还系统比较了不同给药途径对标记特异性的影响：D1/D2 MSN增强子在所测各给药途径间的特异性无显著差异（Kruskal-Wallis检验，p=0.796）；但对纹状体中间神经元增强子而言，特异性在RO注射下最高、STX注射下最低（两者差异显著，p<0.05），ICV居中（63%-91%），提示脑实质内注射中间神经元增强子时需谨慎优化剂量。 

图5 不同给药途径下的标记特异性

在特异性方面，AiE0452h的IHC为96%、scRNA-seq为97%，mFISH约为83%。它还被成功用于驱动多种功能转基因：除荧光报告蛋白外，还包括iCre(R297T)重组酶（iCre为哺乳动物密码子优化的改良型Cre；R297T为第297位精氨酸→苏氨酸的减毒突变，可降低脱靶重组和神经元毒性）、FlpO重组酶、ChR2光遗传学通道和jGCaMP8s钙指示剂。需要注意的是，不同转基因的最佳表达剂量不同——例如表达CoChR-EGFP和jGCaMP8s所需的病毒剂量分别是SYFP2的2倍和5倍，但特异性均得到良好维持。

在南方猪尾猕猴实验中，AiE0452h驱动单体蓝绿色荧光蛋白-1（mTFP1），经STX注射入Put，D2 MSN特异性达到97%。将D1（AiE0780m-SYFP2）与D2（AiE0452h-mTFP1）两种增强子AAV混合后经STX分别注射入南方猪尾猕猴Cd和Put，95%的细胞仅表达其中一种荧光蛋白，仅约5%出现SYFP2⁺/mTFP1⁺共标记，轴突末梢分别定位于GPi和GPe，显示出接近完全的互斥标记。

图6 南方猪尾猕猴特异性验证

多重标记（同时标记多种细胞类型）是这套工具箱的显著能力。研究将靶向Sst-Chodl、Pvalb-Pthlh与胆碱能三类纹状体中间神经元的增强子AAV（分别驱动SYFP2、mTFP1和tdTomato）混合后经RO注射入小鼠，三种荧光蛋白在背侧纹状体中互斥标记各自的靶细胞群，三类中间神经元被同时、清晰地分辨开来，几乎不存在共标记细胞。

图7 多重病毒标记实现野生型小鼠三类不同纹状体中间神经元亚类的识别

进一步地，多重标记还能服务于电生理层面的细胞身份识别：对同时注射三种中间神经元增强子AAV的小鼠，膜片钳记录可依据动作电位半宽、频率-电流（F-I）曲线斜率、静息膜电位和输入阻抗等电生理特征，将三类纹状体中间神经元清晰区分。

研究将增强子AAV与常用的GENSAT BAC转基因Cre品系做了直接对比。D1-Cre品系EY217除纹状体外，在嗅结节（OT）Calleja岛（ICjs）的颗粒细胞和新皮层第6层也有表达；D2-Cre品系ER44则在中脑多巴胺神经元（黑质致密部SNc/腹侧被盖区VTA）中也有Cre重组。相比之下，AiE0779m_3xC2和AiE0452h驱动的iCre(R297T)重组更局限于纹状体，几乎没有这些纹状体外表达。此外，增强子AAV可用于任意基因型、任意年龄的动物，无需复杂繁育，且能快速更换转基因载荷。

增强子AAV的一个核心优势是跨物种适用性。研究通过ATAC-seq比较了五个增强子位点在人、猕猴、小鼠和大鼠纹状体与皮层中的染色质可及性，发现绝大多数增强子在各物种纹状体中均表现出差异性富集的开放染色质。体内实验进一步证实：大鼠中pan-MSN、D1和D2增强子的表达模式与小鼠一致；猕猴中D1和D2增强子均能实现密集且特异的MSN标记。

 图8 跨物种保守性

研究也指出了工具箱的局限。一是RO注射下GCaMP和ChR2等功能转基因的直接表达往往不足，即便提高剂量也常不理想，应改用STX注射；二是多重标记时特定增强子组合可能出现“增强子串扰”，且这种串扰具有脑区特异性（例如在皮层中观察到而纹状体中没有），其分子机制尚不清楚；三是STX注射下部分增强子（尤其是中间神经元增强子）的特异性会下降，可能与感染复数（MOI）过高有关。