IF=17.5【客户文章】武科大田波/华科大张培/南方医王雪敏揭示LC-BLA环路D2受体介导再巩固窗口期内急性束缚干预消除恐惧记忆的机制

该研究首先建立了FR（Fear Reinstatement）诱导的条件性恐惧记忆重现小鼠模型。小鼠经Conditioning、Recall和Extinction阶段后，第6天在条件刺激（CS，纯音）缺失的情况下接受3次足电击（即FR刺激），次日Retrieval测试显示FR组僵直反应显著高于NFR组，提示消退训练后的恐惧行为可被FR重新诱发。进一步采用Tet-off系统标记Conditioning阶段激活的BLA^engram群体（mCherry⁺），并用c-Fos抗体标记Retrieval阶段再激活细胞（c-Fos⁺），结果显示FR显著增加mCherry⁺c-Fos⁺双阳性细胞数量和比例，说明恐惧记忆重现伴随BLA^engram再激活（图1）。

图1. 消退训练后的恐惧行为可被FR重新诱发，并伴随BLA^engram再激活

为了明确在记忆再巩固窗口期内给予急性束缚干预（Ext-Res干预）能否阻止恐惧记忆复发，小鼠在第3-5天每日Extinction结束后立即接受6小时束缚（恰覆盖消退后10 min–6 h的记忆再巩固窗口）。结果显示，Ext-Res组在Retrieval阶段的僵直水平显著低于单纯消退组。细胞标记结果显示，Ext-Res干预对mCherry⁺细胞数量无影响，但显著降低了Retrieval阶段c-Fos⁺细胞、mCherry⁺c-Fos⁺双阳性细胞的数量及其比例，提示Ext-Res干预可阻止恐惧行为复发并降低BLA^engram再激活（图2）。

图2. Ext-Res干预可阻止恐惧行为复发并降低BLA^engram再激活。

接下来，为了证实单独Extinction处理无法消除BLA^engram编码与存储的恐惧记忆，运用Tet-off系统在Conditioning阶段标记恐惧相关BLA^engram群体，之后进行Recall、Extinction阶段测试，结果发现激活单独Extinction处理组（Ext组）BLA^engram神经元依然可诱发小鼠出现僵直行为。类似地，GCaMP6m光纤记录结果也显示，相比NFR对照组，FR处理依然可激活BLA^engram神经元的活性，说明单独Extinction处理无法消除BLA^engram编码与存储的恐惧记忆（图3）。

图3. 单独Ext处理无法消除BLA^engram编码与存储的恐惧记忆。

为了进一步证实Ext-Res联合干预能消除BLA^engram编码与存储的恐惧记忆，同样使用Tet-off系统在Conditioning阶段标记恐惧相关BLA^engram群体，经过Ext-Res联合干预后，在蓝光激活BLA^engram期间，Ext-Res组小鼠的僵直比例较单独Ext组明显下降，光纤记录结果显示Ext-Res联合干预组BLA^engram神经元活性也显著降低，提示Ext-Res联合干预作用于BLA^engram神经元并消除其编码与存储的恐惧记忆（图4）。

图4. Ext-Res联合干预能消除BLA^engram编码与存储的恐惧记忆。

在神经环路机制上，该研究首先通过工具病毒顺行示踪、逆行跨单突触示踪以及光遗传-光纤记录共同证明了LC^TH神经元与BLA^engram存在直接结构连接与功能联系，说明LC^TH神经元向BLA^engram神经元存在直接投射（图5）。

图5. LC^TH神经元向BLA^engram神经元存在直接投射。

随后的化学遗传学双向操控显示，激活LC^TH-BLA环路可模拟Ext-Res干预的治疗效果，抑制该环路则可逆转Ext-Res干预的治疗作用，表明LC^TH-BLA环路在Ext-Res阻止恐惧行为复发中起重要作用（图6）。 

图6. 兴奋或抑制LC^TH-BLA环路可分别模拟或逆转Ext-Res干预的治疗效应。

为进一步阐明LC^TH-BLA环路发挥作用的突触前机制，该研究通过在BLA^engram中表达多巴胺递质探针DA3m或Norepinephrine探针NE2h，发现Ext-Res干预阶段BLA^engram多巴胺信号显著升高，而Norepinephrine无变化。光遗传激活LC^TH神经元亦可促进多巴胺向BLA^engram释放，提示LC^TH-BLA环路可能通过多巴胺递质系统参与Ext-Res对恐惧行为复发的治疗效应（图7）。

图7. Ext-Res干预激活LC^TH神经元，促进其向BLA^engram释放多巴胺。

最后，为证实多巴胺递质在LC^TH-BLA环路发挥作用的突触后受体机制，通过在BLA脑区直接注射D1受体或D2受体拮抗剂，结果发现D2受体拮抗剂能明显阻断Ext-Res治疗效果，而D1受体拮抗剂无作用。脑片电生理和小鼠行为实验进一步证实，D2受体拮抗剂可逆转LC^TH-BLA环路激活抑制BLA^engram放电、减少恐惧行为复发的作用，说明Ext-Res干预通过LC^TH-BLA环路D2受体信号消除恐惧记忆（图8）。 

图8. Ext-Res干预通过LC-BLA环路D2受体信号消除恐惧记忆。

图9. Ext-Res经“LC^TH激活→多巴胺-D2受体信号→抑制BLA^engram再激活”消除恐惧记忆、阻止复发的机制示意图。

该项研究也存在以下局限性：第一，BLA^engram群体的细胞类型及其与以往文献鉴定的Ppp1r1b⁺亚群之间的关系仍需阐明；第二，LC^TH神经元共释放的Norepinephrine及其受体的生物学作用仍待解析；第三，Ext-Res干预在临床转化上需要更多证据支撑，未来需要确定束缚时长、强度和时窗阈值，并探索能否以药物、无创神经调控等方法替代束缚干预。

总体而言，该研究立足于记忆印迹细胞，在动物模型中揭示了Ext-Res干预阻止PTSD暴露疗法后恐惧复发的神经机制，并为在记忆再巩固窗口期内实施干预以消除PTSD恐惧记忆提供了新的视角。

田波教授课题组长期联合应用分子生物学、细胞生物学、动物行为学、病毒神经示踪、光/化学遗传学、电生理、钙成像、转录组学、蛋白组学和生物信息学等技术，解析多巴胺能神经元参与生理（如共情、恐惧记忆形成与消退）及病理（如帕金森病、抑郁症、PTSD）过程的神经环路与分子机制。课题组长田波教授在中外期刊发表论文80余篇，其中以通讯作者或第一作者在Neuron、Nature Cell Biology、PNAS、Nature Communications、Gastroenterology、PLOS Biology、Neuropsychopharmacology、Cell Reports等期刊发表研究成果，并以第一申请人申请和获批国家发明专利及实用新型专利6项；近年来主持国家自然科学基金项目7项，主持多项省部级及企业横向项目，获湖北省杰青项目。