【新手指南】小白速看！一文带你读懂ATLAS——新型顺行跨单突触神经示踪工具

简介

大脑功能依赖神经元间精准的信息传递，解析特定神经元的输出连接、明确其信息投射靶点，是揭示神经环路机制的核心。科研界长期亟需一款工具：能从基因指定的起始神经元出发，严格沿着顺行方向（突触前→突触后）精准标记单突触连接的下游神经元。然而当前主流顺行示踪工具均存在短板：单纯疱疹病毒（HSV-1）与水疱性口炎病毒（VSV）经改造后虽能实现顺行跨单突触示踪，但存在神经毒性与逆行扩散泄漏现象；腺相关病毒1型（AAV1）、黄热病病毒（YFV）虽可顺行运输，却缺乏起始神经元的细胞类型特异性，还存在跨突触效率不稳定及潜在的逆行污染问题，难以满足现代神经环路研究的精准要求。2025年5月发表于Nature Methods（IF=36.1）的重磅研究“ATLAS: a rationally designed anterograde transsynaptic tracer”，开发出新型蛋白示踪工具ATLAS（anterograde transsynaptic label based on antibody-like sensors，基于抗体样传感器的顺行跨突触标记），实现从基因指定神经元出发的严格顺行、单突触、非毒性且活性依赖的跨神经元示踪，为神经环路解析提供了全新技术方案。

技术原理

ATLAS的巧妙之处在于，它是一种理性设计的融合蛋白，由可独立替换的功能模块组成，其工作机制高度模仿了生理性的突触传递过程。

1、ATLAS核心模块化组件

VAMP2：突触前蛋白——突触小泡蛋白2，介导ATLAS靶向突触小泡。在优化版本ATLASsn中将VAMP2的胞质结构域替换为靶向突触结合蛋白1的纳米抗体（SYTnb）形成SYTnb-VAMP2Δ，从而消除全长VAMP2高表达带来的神经毒性；

At：ALFA-tag，一种高亲和力的小型合成抗体标签，用于可视化ATLAS蛋白在起始神经元的表达与分布；

BACEcs：β分泌酶（BACE1）特异性切割位点，切割后释放效应片段（AF-重组酶）；

AF（AMPA.FingR）：mRNA展示技术筛选的抗体样纤连蛋白，特异性结合突触后膜GluA1（AMPA型离子型谷氨酸受体关键亚基）N端胞外域；

重组酶（Cre/Flp）：在核定位信号引导下入核，触发重组酶依赖的报告基因表达，实现对单突触下游细胞的荧光标记。

2、ATLAS顺行跨单突触步骤

1）突触小泡靶向：ATLAS经VAMP2（或优化版SYTnb-VAMP2Δ）定位至起始（突触前）神经元的突触小泡；

2）酶切释放：BACE1切割BACEcs，释放AF-重组酶效应片段；

3）突触间隙释放：突触小泡与突触前膜融合，效应片段释放至突触间隙；

4）突触后特异性结合：AF精准结合突触后膜GluA1 N端，将效应片段牢牢固定在突触后膜表面；

5）内吞入胞：AF-重组酶经网格蛋白介导的内吞作用进入突触后神经元；

6）核内报告激活：重组酶在核定位信号引导下入核，触发重组酶依赖（loxP/frt系统介导）的报告基因（如GFP、mCherry）表达，标记突触后细胞。

图1. ATLAS的跨突触运输及体外测试的示意图

（Rivera, Jacqueline F et al., Nature methods, 2025）

ATLAS系统应用要点

1.病毒搭配方案：AAV-ATLASsn_Cre-WPRE-pA与AAV-DIO-mCherry/EGFP搭配使用，具体为上游脑区注射ATLASsn_Cre病毒，下游靶区注射DIO-mCherry/EGFP病毒。

2.效率优化策略：实验结果表明，当上游脑区混合注射AAV-ATLASsn_Cre-WPRE-PA与补充外源性BACE的AAV-hSyn-HA-BACE-WPRE-PA（混合比例为BACE:ATLASsn_Cre=5:1），同时下游靶区注射DIO-mCherry/EGFP时，可显著提升跨单突触标记效率。

3.示踪层级限制：ATLAS系统仅能实现顺行跨单突触示踪，无法用于顺行跨多突触的研究。

4.方向特异性：ATLAS系统几乎无逆行跨突触标记，其跨单突触示踪具有严格的顺行性。

5.适用细胞类型：标记下游GluA1阳性细胞。

6.活动依赖性特征：当上游注射区域的细胞被激活时，下游靶区的DIO-mCherry/EGFP荧光强度会显著增加。

应用案例

1、精准解析mPFC-Str环路

研究者将ATLASsn（AAV8-ATLASsn_Cre）与BACE辅助病毒AAV8-BACE-HA共注射至小鼠内侧前额叶皮层（mPFC），在纹状体（Str）注射报告病毒AAV8-DIO-mCherry。2周后观察结果显示，mPFC的起始神经元被成功标记（At免疫组化染色），且Str中出现了大量红色mCherry标记的突触后神经元；突触后mCherry标记的背侧区域与来自mPFC的突触前末梢At标记几乎完全共定位，证实了ATLASsn的高效顺行跨突触能力（图2）。

2、实现“一到多”多靶点同步示踪（M1-Str/Thal）

研究者将AAV8-ATLASsn_Cre与AAV8-BACE-GFP共注射至小鼠初级运动皮层（M1），同时在Str和丘脑（Thal）注射报告病毒AAV8-DIO-mCherry，2周后可同时观测到M1起始神经元标记（GFP），以及Str、Thal内特异性的下游神经元荧光信号（mCherry），两种荧光信号高度重叠，标记结果与已知解剖环路完全吻合。仅注射报告病毒的对照组无明显背景信号，证明ATLASsn可高效完成单脑区起始→多下游脑区的顺行跨突触示踪，特异性强、背景极低，适配复杂环路的多靶点解析需求（图2）。

图2. ATLASsn的跨突触示踪

（Rivera, Jacqueline F et al., Nature methods, 2025）

3、实现从基因指定神经元出发的严格顺行

为实现基因定义示踪，研究者构建了Cre依赖性表达的AAV8-DIO-ATLAS_FLP（携带Flp重组酶），进一步在VIPR2-Cre转基因鼠（仅背外侧膝状核（dLGN）神经元中表达Cre）的dLGN注射AAV8-DIO-ATLAS_FLP，借助Cre依赖特性实现仅dLGN神经元表达ATLAS，从而实现了严格的起点特异性；在其投射脑区初级视皮层（V1）注射Flp依赖的AAV8-fDIO-mCherry。结果在dLGN中特异性检测到At染色，并成功在V1的IV层（主要投射层）及II/III和V层观察到符合解剖学特征的mCherry标记。证明ATLAS能有效介导从基因定义神经元出发的顺行跨突触示踪（图3）。

图3. 在VIPR2-Cre小鼠中实现从基因指定神经元dLGN到V1的严格顺行跨突触示踪

（Rivera, Jacqueline F et al., Nature methods, 2025）

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