【客户文章-LV应用】上海中医药大学邵水金教授团队揭示电针促周围神经再生新机制——MIAT/miR-130a-3p/KLF7轴

研究人员通过步态分析计算坐骨神经功能指数（SFI），开展电生理实验测量神经传导速度（NCV）恢复率，并比较腓肠肌湿重比（WWRG）评估肌肉萎缩。DigiGait成像（步态成像分析系统）显示，假手术组足迹清晰、脚趾完全展开，模型组与EA组均见脚趾收缩，但EA组展开程度更大；EA组SFI显著升高，NCV高于模型组，腓肠肌萎缩明显改善。免疫荧光与透射电镜进一步显示，EA组受损坐骨神经的轴突数量、髓鞘数量与厚度较模型组显著增加，提示EA可显著促进PNI后神经修复。

图1 EA促进大鼠周围神经再生

对受损坐骨神经切片进行免疫荧光染色，结果显示EA干预后横切面中CD206（M2标志物）阳性细胞数量显著增加；实时荧光定量PCR（qPCR）印证EA组M2标志物CD163、Arg-1、MRC1的mRNA水平明显高于模型组，表明EA促进坐骨神经巨噬细胞向M2表型极化。

图2 坐骨神经组织中M2巨噬细胞极化评估

体外以脂多糖（LPS）诱导M1、白细胞介素-4（IL-4）诱导M2，验证显示：M0表达F4/80，LPS组高表达iNOS、CD86、TNF-α、IL-1β，IL-4组表达CD206、CD163、MRC1、Arg-1，即表型诱导成功。随后收集M0、M1、M2巨噬细胞来源外泌体，经蛋白质印迹（WB）、透射电镜（TEM）与纳米颗粒追踪分析（NTA）鉴定了CD9、CD63、粒径分布（约50-150 nm）与杯状形态（直径约100 nm）。

将NG108-15神经细胞分别与外泌体M0-exo、M1-exo、M2-exo共培养48 h。CCK-8显示M2-exo可增强细胞活力，M1-exo显著抑制活力；βIII-tubulin免疫荧光显示，M2-exo共培养细胞的平均与最长轴突长度均显著大于另外两组，表明M2来源外泌体可促进神经细胞活性与轴突生长。

图3 不同表型巨噬细胞外泌体的鉴定及其对神经细胞的作用

EA干预后的PNI大鼠血清外泌体与坐骨神经中均可检测到较高水平MIAT，EA组明显高于模型组与假手术组；M2巨噬细胞及其外泌体中MIAT亦高于M0与M1。为证明MIAT经外泌体递送至神经细胞，研究将CD63-GFP质粒转染M2巨噬细胞，其外泌体与NG108-15共培养后CD63-GFP被神经细胞摄取；结合MIAT探针的荧光原位杂交（FISH）与抗CD63免疫荧光，二者在胞质囊泡中清晰共定位，为M2-exo-lncRNA MIAT被内化提供了直接证据。

功能验证中，LV介导MIAT过表达使NG108-15活力升高、突起生成增强；在M2巨噬细胞中转染siMIAT（小干扰RNA）敲低MIAT或以GW4869抑制外泌体后，其外泌体处理使NG108-15细胞活力与突起生长均受抑制。在氧糖剥夺（OGD）模型中，M2-exo可减轻细胞毒性，GW4869与siMIAT则消除该保护效应，说明M2-exo的神经保护依赖外泌体递送的lncRNA MIAT。

图4 M2巨噬细胞外泌体lncRNA MIAT增强NG108-15细胞活力与形态发生

体内验证中，大鼠在坐骨神经损伤建模后即刻于坐骨神经局部注射LV-MIAT以过表达MIAT：局部过表达显著促进运动能力、改善神经功能并减轻肌肉萎缩；神经丝蛋白200（NF200）与髓鞘碱性蛋白（MBP）免疫荧光显示轴突、髓鞘再生相关细胞增多，电镜证实髓鞘数量与厚度改善；同时LV-MIAT还促进损伤局部M2极化，表型与EA治疗效应一致，提示局部补充MIAT可模拟EA的促再生作用。

反向验证中，采用AAV-siMIAT于坐骨神经局部敲低MIAT，并以GW4869抑制外泌体分泌：二者均显著减弱EA对运动恢复的疗效，阻碍轴突再生与髓鞘形成，免疫荧光指标与模型组无统计学差异，电镜下髓鞘变薄，EA促M2极化的效应也被削弱。这表明外泌体lncRNA MIAT是介导EA在PNI修复中免疫调节作用的关键环节。

图5 lncRNA MIAT在PNI后神经再生与M2极化中的调控作用

 

图6 敲低lncRNA MIAT影响神经再生与M2极化

FISH与核质RNA分离显示，MIAT同时分布于细胞质与细胞核，提示其可能经核内调控miRNA生成及细胞质内竞争性内源RNA（ceRNA）机制发挥作用。结合TargetScan、starBase、miRDB三个数据库预测候选miRNA与MIAT的潜在结合位点，并用逆转录qPCR（RT-qPCR）验证候选miRNA的表达变化，最终锁定miR-130a-3p：体内过表达MIAT使坐骨神经miR-130a-3p减少，EA促修复的同时亦下调miR-130a-3p；双荧光素酶实验证实MIAT与miR-130a-3p可直接结合。功能上，miR-130a-3p的过表达抑制NG108-15活力与突起生长，抑制剂的效应则相反；miR-130a-3p过表达可下调细胞内MIAT与KLF7表达。

预测与双荧光素酶实验证实miR-130a-3p直接靶向KLF7；在NG108-15细胞中，miR-130a-3p模拟物（mimic）使KLF7 mRNA下调、抑制剂（inhibitor）使其上调，二者呈负相关；体内KLF7在PNI后显著下调，EA干预后其mRNA与蛋白水平均回升。由此形成EA调控外泌体MIAT、经miR-130a-3p/KLF7轴增强神经细胞活力与突起生长的调控链条。

图7 miR-130a-3p调控NG108-15细胞活力与突起生长

 

图8 miR-130a-3p/KLF7轴参与EA治疗PNI

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