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武汉枢密脑科学技术有限公司
入驻年限：8 年
- 联系人：
枢先生
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湖北 武汉市 江夏区
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抗体、试剂、细胞库 / 细胞培养、技术服务、耗材、实验室仪器 / 设备
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IF=15.7【新品推荐】告别AAV异位表达毒性｜核心靶向耳蜗支持细胞的GRE启动子上新！
114 人阅读发布时间：2026-10-09 13:51
DFNB1是全球最常见的常染色体隐性非综合征性遗传性耳聋，由GJB2（编码连接蛋白26）基因突变所致，在撒哈拉以南非洲以外地区占先天性耳聋病例的最高可达50%。GJB2生理条件下表达于上皮细胞体系（包含柯蒂器支持细胞、内外沟耳蜗上皮细胞、齿间细胞）以及结缔组织体系的成纤维细胞，不在感觉毛细胞、螺旋神经节神经元中表达。既往研究使用重组腺相关病毒（rAAV）搭载广谱强启动子开展GJB2基因增补治疗，但治疗效果很不理想：广谱启动子会驱动GJB2在毛细胞、神经元异位表达，异常间隙连接会改变细胞电生理活性，带来听力下降甚至动物死亡的毒性，无法实现听力功能的实质性挽救。
哈佛医学院David P. Corey教授团队于Nature Communications在线发表了题为“Cell-specific delivery of GJB2 restores auditory function in mouse models of DFNB1 deafness and mediates appropriate expression in NHP cochlea”的研究论文，利用转座酶可及染色质测序（ATACseq）筛选出两个GJB2基因调控元件（GREs），规避rAAV衣壳无法精准区分耳蜗多种细胞类型的局限，依靠顺式调控序列实现GJB2的细胞特异性转录。GRE元件可限制目的基因仅在耳蜗内源表达GJB2的细胞中激活，不在毛细胞中启动转录。研究在两种DFNB1小鼠模型中完成药效验证，并在食蟹猴（非人灵长类，NHP）模型上验证其表达特异性与体内安全性，为DFNB1耳聋的临床前基因治疗提供全新工具方案。
枢密科技重磅推出GRE顺式调控元件系列rAAV工具！依托文献验证的人源GRE1+GRE2调控序列，复刻耳蜗内源GJB2表达谱，核心靶向耳蜗支持细胞，同时覆盖螺旋韧带成纤维细胞等内源GJB2阳性细胞，完全规避广谱启动子带来的毛细胞、神经元异位表达毒性问题；可搭载目的基因、示踪标签等，适配DFNB1遗传性耳聋机制研究、基因治疗前期评估等内耳实验。为耳蜗非感觉细胞功能解析、耳聋基因治疗预临床探索提供精准递送工具。选择枢密科技，解锁耳蜗GJB2阳性细胞靶向基因研究新维度！详情见文末～
1、GRE元件可限制rAAV介导的基因表达，规避毛细胞异位表达
研究取P2、P5、P8新生小鼠耳蜗开展ATACseq，筛选Gjb2基因座附近开放染色质区域，排除神经元样本共有的开放区域，筛选哺乳动物保守序列，最终确定两段核心GRE元件：GRE1（包含非编码外显子1及其上游约200 bp推定启动子区域）、GRE2（外显子2的3'非编码片段）。为更贴合临床转化需求，研究后续选用人源GRE序列用于载体构建。
图1. ATACseq筛选候选GRE用于限制病毒GJB2表达
将GRE元件置于报告基因增强型绿色荧光蛋白（eGFP）两侧构建rAAV载体，经圆窗膜（RWM）注射新生小鼠耳蜗。结果显示：GRE驱动的eGFP表达模式和内源Gjb2高度吻合，毛细胞完全无报告基因表达；而广谱鸡β-肌动蛋白（CBA）启动子对照组则大量在内毛细胞（IHCs）、外毛细胞（OHCs）表达。随后，研究者将GJB2（小鼠或人源）编码序列连同C端HA标签（血凝素标签，用于示踪病毒表达蛋白）置于GRE控制下构建rAAV载体，经RWM对P1新生小鼠耳蜗进行注射，P30时取材耳蜗检测HA标签。免疫荧光证实蛋白正确定位于细胞膜形成间隙连接，只出现在耳蜗支持细胞、螺旋韧带成纤维细胞等内源GJB2阳性细胞，毛细胞无信号。
图2. GRE在小鼠耳蜗中实现GJB2细胞特异性表达
2、不同DFNB1小鼠模型的药效差异（HA标签会干扰GJB2蛋白功能）
研究中使用到两种DFNB1小鼠模型：
1.Gjb2条件敲除小鼠（Gjb2Pfl/Pfl, Cre+）：由Sox10-Cre品系表达的Cre重组酶介导耳蜗Gjb2敲除。P6时耳蜗支持细胞中GJB2已缺失；P30柯蒂器毛细胞、支持细胞退变，听性脑干反应（ABR）阈值≥120 dB，表现为全频重度耳聋。
向该模型P1小鼠注射带HA标签AAV-GRE-mmGJB2.HA，P30时检测到HA标签在支持细胞、纤维细胞中表达，毛细胞未转导。耳蜗形态得以保存，但ABR阈值仅改善10-15 dB声压级（SPL），畸变产物耳声发射（DPOAE）无改善。
改用无HA标签的人源GJB2（AAV-GRE-hsGJB2）注射后，P30时GJB2网络完全恢复，柯蒂器隧道重建。ABR阈值改善约50 dBSPL，但DPOAE仍无改善，提示外毛细胞功能未得到拯救。
图3. Gjb2Pfl/Pfl，Cre+条件敲除小鼠P30出现感觉上皮退变：AAV-GRE-mmGJB2.HA可抑制组织退变；无HA标签的人源GJB2载体可实现柯蒂器隧道重建
2.Gjb2Gjb6轻度模型：Gjb6编码序列被替换，间接下调GJB2表达，不会完全敲除GJB2；但柯蒂器整体形态和毛细胞存活正常。
带HA标签rAAVGREhsGJB2.HA注射后，P30时尽管靶细胞蛋白高表达，但耳蜗出现多重病理改变：中阶容积缩小、盖膜增厚、OHCs丢失等，提示HA标签修饰会干扰GJB2蛋白生理功能，即便蛋白正确膜定位，依旧无法发挥完整间隙连接功能。
无HA标签rAAVGREhsGJB2注射后，P30时GJB2间隙连接网络完全恢复，耳蜗组织学无异常。扫描电镜证实耳蜗全部回的毛束形态得到完整保护。梯度剂量给药实验证实：高、中、低剂量均可以在P30完全恢复ABR至野生型水平；高、中剂量的听力挽救效果可稳定维持至P90，DPOAE同样得到显著恢复。
图4. rAAV-GRE-hsGJB2对Gjb2Gjb6小鼠病理损伤的挽救作用
图5. 注射rAAV-GRE-hsGJB2.HA的Gjb2Gjb6小鼠出现形态学异常
图6. rAAV-GRE-hsGJB2可以完全挽救Gjb2Gjb6小鼠听力，药效具备剂量依赖性，可长期维持
3、非人灵长类模型中验证表达特异性与安全性
研究使用幼年食蟹猴开展NHP体内验证。rAAV-CBA-eGFP对照组：报告基因广泛表达，毛细胞、螺旋神经节神经元大量转导。而搭载人源GRE元件的rAAV-GRE-hsGJB2.HA载体：外源蛋白仅在SOX2阳性的支持细胞、成纤维细胞表达，IHCs、OHCs无外源蛋白表达；表达模式与NHP内源GJB2基本接近，仅血管纹、柱细胞表达水平略低于内源蛋白。
图7. AAV-GRE-hsGJB2.HA在NHP耳蜗中的表达与内源性GJB2一致
组织病理学苏MU精-伊红（H&E）染色、离子钙结合衔接分子1（IBA1，巨噬细胞标志物）染色结果显示：载体处理耳蜗组织结构完整，没有明显炎症浸润。听力检测：3只给药耳朵中2只听力无明显下降，仅1只耳朵出现阈值轻度升高，判定为乳突外科术后中耳改变导致，并非载体毒性。该结果证实GRE元件在灵长类体内同样具备细胞特异性，载体具备良好体内安全性。
图8. 组织学评估表明无载体毒性
研究意义与局限
研究意义：
1.本研究证明，仅依靠rAAV衣壳血清型无法实现GJB2靶细胞精准表达，利用内源顺式基因调控元件GRE，可在不改变衣壳的前提下，将外源GJB2限制在耳蜗生理表达的细胞中，消除毛细胞、神经元异位表达带来的毒性，为DFNB1基因治疗解决关键安全隐患。
2.证实蛋白标签（HA）会干扰GJB2间隙连接生理功能，基因治疗必须使用无修饰的天然GJB2编码序列，为后续载体设计提供重要参考。
3.人源GRE元件可以跨物种（小鼠、NHP）发挥调控活性，为临床前转化研究奠定基础；同时在NHP上完成表达特异性、安全性验证。
4.研究提示GJB2在发育不同阶段、不同耳蜗细胞承担多重生理功能，不同动物模型治疗响应存在差异；即便靶细胞表达正确，依旧需要足够早的干预窗口。
研究局限：
1.在完全敲除Gjb2的条件敲除小鼠，即便使用GRE+无标签hsGJB2，DPOAE依旧无法恢复，尚未实现全部听觉指标完全恢复。
2.本研究使用的GRE为两段组合元件，尚未确定发挥功能的最小核心序列；更远端ATACseq峰对应的GRE元件还待进一步开发，有机会进一步提升表达强度。
3.NHP实验使用HA标记的GJB2，未在灵长类开展无标签GJB2的功能学药效实验，仅完成表达与安全性评估。
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