【客户文章】Curr Biol︱薰衣草芳香疗法！陶文娟教授/曹鹏教授/张智教授团队揭示薰衣草精油缓解偏头痛的食欲素能多级神经环路机制

1. LEO吸入缓解慢性偏头痛模型小鼠的疼痛样行为

研究团队首先验证了LEO的镇痛效应。通过隔日腹腔注射不同剂量（0.1、1.0、10 mg/kg）硝酸甘油（NTG），发现1.0 mg/kg可稳定诱导小鼠偏头痛样行为且不影响基本生理功能，故选用该剂量建立慢性偏头痛模型。造模第9天起，连续3天每日吸入0.1%LEO 1小时。行为学检测显示，与对照组（荷荷巴精油，JEO）相比，LEO吸入显著降低口面部von Frey机械痛评分；小鼠面部痛苦表情（眶周收紧、耳朵后缩）的频率和时长明显减少。此外，佛手柑精油（BEO）和茴香酮（fenchone）吸入均未产生类似镇痛效果。这些结果表明，0.1%LEO吸入可特异性缓解NTG诱导的慢性偏头痛样行为。 

图1 慢性偏头痛小鼠模型中LEO的镇痛作用。

2. LEO激活LH食欲素神经元并抑制LPBN^CGRP神经元

为明确LEO作用的神经环路机制，研究团队首先通过c-Fos染色筛查全脑激活区域。与对照相比，LEO吸入后小鼠前嗅核（AON）和外侧下丘脑（LH）的c-Fos⁺细胞显著增加，而偏头痛相关的外侧臂旁核（LPBN）中升高的c-Fos⁺细胞数目被逆转。LH中c-Fos⁺神经元约60%与食欲素（OX）能神经元共标，LPBN中c-Fos主要与CGRP共标，且LEO吸入后c-Fos⁺ CGRP⁺共标细胞减少。光纤记录显示，偏头痛小鼠口面部机械刺激时LPBN^CGRP神经元钙信号升高，LEO吸入后该升高被抑制；同时LEO可引起LH^OX神经元钙信号快速上升。这些结果表明，LEO可特异性激活LH^OX神经元，并有效抑制偏头痛状态下LPBN^CGRP神经元的异常激活。

图2. LEO对LH^OX和LPBN^CGRP神经活动的调控。

3. LH^OX神经元通过激活LPBN^GABA中间神经元抑制LPBN^CGRP神经元

为明确LH^OX→LPBN通路连接，研究团队向Orexin-Cre小鼠（食欲素能神经元特异性表达Cre重组酶）的LH注射Cre依赖性光遗传学激活重组腺相关病毒（rAAV-DIO-ChR2-mCherry）。脑片电生理记录显示，光激活LH^OX神经末梢可显著增加LPBN γ-氨基丁酸（GABA）能神经元放电频率，灌注食欲素A（Orexin A）同样增强LPBN^GABA神经元活性，提示LH^OX对LPBN^GABA提供兴奋性输入。进一步向GAD2-Cre小鼠（GABA能抑制性神经元特异性表达Cre重组酶）LPBN注射rAAV-DIO-ChR2-mCherry，在LPBN^CGRP神经元上记录到光诱发的抑制性突触后电流（IPSCs），该电流可被GABA受体拮抗剂PTX阻断，且光激活LPBN^GABA后LPBN^CGRP神经元放电显著减少，表明LPBN^GABA中间神经元直接抑制局部LPBN^CGRP神经元。为在体验证该微环路功能，团队利用rAAV-VGAT1-taCasp3选择性消融LPBN^GABA后，光激活LH^OX不再引起LPBN^CGRP钙信号降低。综上，LH^OX通过兴奋LPBN^GABA中间神经元继而抑制LPBN^CGRP神经元，构成LH^OX→LPBN^GABA→CGRP抑制性微环路。 

图3. LH^OX→LPBN^GABA→CGRP环路的功能连接。

4. LPBN^GABA神经元OX2R介导LEO的镇痛效应

OX信号主要通过食欲素1受体（OX1R）和食欲素2受体（OX2R）介导。研究团队通过免疫荧光染色检测LPBN中两种受体的表达模式，发现OX2R（而非OX1R）可与LPBN^GABA神经元共定位，提示LPBN^GABA神经元主要表达OX2R。光纤记录显示，光激活LH^OX可抑制LPBN^CGRP神经元活性，该效应可被OX2R拮抗剂Seltorexant完全阻断，而OX1R拮抗剂SB-334867无效。偏头痛模型中，LPBN局部给予Seltorexant可消除LEO的镇痛效果，SB-334867则无影响。这些结果表明，LPBN中OX2R信号是LEO发挥镇痛效应的关键分子基础。

图4. LPBN^GABA神经元上OX2R上对LEO诱导的偏头痛镇痛至关重要。

5. AON→LH神经通路介导LEO的镇痛效应

最后，为了探究气味分子如何调控LH^OX→LPBN神经通路的功能，研究团队通过狂犬病病毒（RV）逆向跨单突触示踪策略，发现在前嗅核（AON）[而非梨状皮层（Pir）和嗅球（OB）]中，存在大量谷氨酸（Glu）能投射神经元。后续通过多种病毒示踪策略验证确实存在AON^Glu→LH^OX→LPBN的多级神经通路，并通过化学遗传学调控验证了其在LEO介导镇痛中的作用。

图5. AON在LEO介导的慢性偏头痛缓解效应中的作用

总之，本研究揭示了一条从前嗅核到外侧臂旁核的多级神经环路（AON^Glu→LH^OX→LPBN^GABA→CGRP）在LEO缓解慢性偏头痛中的核心作用，阐明LEO通过激活AON^Glu神经元对LH^OX神经元的兴奋性输入，进而经OX2R激活LPBN^GABA中间神经元、抑制LPBN^CGRP神经元活性，最终缓解偏头痛样行为的神经机制。这一发现不仅为芳香疗法镇痛的中枢环路机制提供了理论依据，也为偏头痛的非药物干预提供了新靶点——通过调控该食欲素能通路，或可为药物治疗偏头痛提供安全、经济的辅助干预策略。 

图6. LEO缓解慢性偏头痛的食欲素能多级神经环路模式图