【新品推荐】cOpn5：一款可用于Gq信号精准调控的高性能单组分光遗传工具

在HEK293T细胞体系中，研究通过药理学与生化实验确认了cOpn5的信号通路属性：

• 蓝光刺激可诱发胞内钙信号升高，无胞外钙环境下响应依然存在，提示钙信号来源于胞内钙库释放；

• Gq特异性抑制剂YM-254890能够可逆阻断光诱发的钙信号；同时光刺激可引起肌醇一磷酸（IP₁，IP₃的降解产物）水平升高，支持信号通过Gq-PLC-IP₃通路介导；

• 光刺激可诱导MARCKS蛋白（PKC经典下游底物）磷酸化，该效应可被PKC抑制剂阻断，验证了下游PKC通路的激活；

• 不加外源性视黄醛时，cOpn5激活对胞内cAMP水平无显著影响，未观察到明显的Gi通路交叉激活。HEK293T细胞中钙响应峰值约3 ΔF/F，响应幅度显著优于同类Gq光遗传工具。

   

图1 cOpn5介导HEK293T细胞Gq信号通路激活

在HEK293T细胞体系中，研究对cOpn5的光谱、灵敏度、动力学、空间精度等参数进行了定量测定，核心性能显著优于现有同类工具：

• 光谱特性：在365–630 nm测试波长范围内，470 nm蓝光激活效率最高，紫外光激活效果较弱，561 nm及以上波长基本无激活效应；

• 超高光灵敏度：16 μW/mm²光强下，仅需10 ms短脉冲即可达到饱和钙响应；半最大激活光强约4.8 μW/mm²。与现有Gq通路视蛋白工具横向对比：opto-α₁AR需额外添加全反式视黄醛（ATR）辅因子，且7 mW/mm²光强持续照射60 s才能诱发微弱钙响应，激活光强是cOpn5的数百倍，响应幅度仅约0.5 ΔF/F；mOpn4L也需额外添加ATR，且40 mW/mm²光强持续照射25 s才有微弱响应，激活光强是cOpn5的2500倍，响应幅度仅约1 ΔF/F。综合来看，cOpn5光灵敏度比现有Gq通路视蛋白工具高出至少3个数量级，响应幅度也显著更强；即便对比常用通道型光遗传工具通道视紫红质2（ChR2），其灵敏度仍高出2–3个数量级。

• 高时间分辨率：10 ms光刺激后，1 s内即可观测到显著钙信号，约2.5 s达到响应峰值；其中达到峰值10%的时间约1.36 s，达到峰值90%的时间约2.37 s，衰减时间常数τ约18.66 s。与化学遗传工具hM3Dq相比，起效与恢复速度更快；刺激时程从现有Gq光遗传工具的数十秒缩短至毫秒级，时间控制精度提升至少3个数量级；

• 高空间分辨率：体外细胞水平可实现单细胞、亚细胞区域的精准光刺激，局部光照可诱发细胞内钙信号传播及细胞间钙波，支持细胞内信号分区、细胞间通讯等精细研究。

   

图2 cOpn5的光响应性能表征与同类工具对比

1）皮层脑片钙成像实验中，将AAV-hSyn-cOpn5-T2A-EGFP与AAV-hSyn-jRGECO1a预混后注射至小鼠皮层，在神经元中共表达cOpn5与红色钙指示剂jRGECO1a，蓝光刺激可诱发皮层神经元钙信号升高。研究同时在皮层、外侧下丘脑（LH）、未定带（ZI）等多个脑区开展脑片全细胞膜片钳记录，证实光刺激均可稳定诱发神经元动作电位发放，重复刺激下未观察到明显的功能衰减；

2）自由行为小鼠中，采用Cre依赖的DIO型AAV配合VGAT-Cre小鼠，分别将cOpn5特异性递送至LH、ZI的GABA能神经元，同时设置EGFP对照；结果显示光激活可显著增加小鼠进食行为、高脂食物觅食行为，且效应随光刺激的开启与终止快速变化，可逆性良好。

与通道型视蛋白不同，cOpn5诱发的神经元动作电位不与光脉冲严格锁时，呈现异步发放模式，可避免大规模神经元同步激活带来的实验伪迹；如果实验需要对动作电位发放进行毫秒级精准时序控制，仍优先选择离子通道型光遗传工具。

图3 cOpn5介导神经元激活与动物行为调控图

体外原代星形胶质细胞采用AAV-cOpn5-T2A-EGFP载体转导；在体实验采用双AAV共注射方案：AAV2/8-GfaABC1D-cOpn5-T2A-mCherry与AAV2/9-GfaABC1D-GCaMP6s联合递送。体外与在体实验均证实，光刺激可稳定诱发星形胶质细胞钙信号。其中体外原代细胞钙响应峰值约8 ΔF/F；在体条件下，920 nm双光子成像激光即可激活cOpn5，适配双光子成像场景，且20 min持续刺激下信号仅小幅衰减，长时程稳定性良好。

图4 光激活cOpn5诱发星形胶质细胞钙信号

在小鼠S1皮层中，混合注射两种靶向不同细胞的AAV（星形胶质细胞GfaABC1D-cOpn5-T2A-mCherry与锥体神经元CaMKII-GCaMP7b）。实验数据显示，激活星形胶质细胞Gq信号后，周围皮层锥体神经元的钙事件频率与解码放电率均显著升高，提示星形胶质细胞激活可对神经元兴奋性产生调控作用。

文中同时给出了AAV载体的表达数据：320个cOpn5-mCherry阳性细胞中，312个为胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性，特异性达97.5%；同一成像区域内共检测到409个GFAP阳性细胞，对应星形胶质细胞标记效率为76.3%。

图5 光激活星形胶质细胞Gq信号诱发ATP释放与神经元兴奋性改变