【实操指南】rAAV储存、分装与稀释的操作规范

重组腺相关病毒（rAAV）是当前神经科学研究中最常用的病毒载体之一。然而，rAAV的储存与稀释恰恰是最容易被忽略、却直接决定病毒活性的基础环节。不少新手因操作不规范导致病毒滴度大幅下降、体内表达效果差，甚至整批实验被迫重来。本文整理了rAAV储存、分装与稀释的全流程操作规范，帮你尽可能保留病毒活性，减少实验误差。

rAAV为复制缺陷型载体，缺失自主复制能力，生物安全风险较低，通常在一级生物安全防护水平（BSL-1）实验室条件下进行操作；若载体携带致病基因等有害因子，则需提升至BSL-2条件下操作。

操作过程需遵守以下基础规范：

• 所有操作均应在Class II生物安全柜中进行。若使用普通的超净工作台操作病毒，请勿开启风机；

• 若发生病毒液溅洒、台面污染，立即用75%乙醇擦拭，再用含氯消毒剂二次处理；

• 病毒离心需在密闭状态（勿开盖）下进行；

• 接触过病毒的枪头、离心管、培养板等需用含氯消毒剂（84消毒液1：20左右稀释）浸泡消毒30分钟以上，再按实验室废弃物规范处置。

rAAV通常采用干冰低温运输，收到快递后需第一时间完成以下核查：

1. 检查干冰余量：确保包装内仍有干冰剩余、病毒管保持完全冻结状态；

2. 核对管身信息：确认病毒管壁标签上的血清型、滴度、体积、批次号与订单一致；

3. 检查管身完整性：确认病毒管无破损、管盖无松动。

核查无误后，尽快完成分装或直接转移至-80℃冰箱保存，避免室温长时间放置。

rAAV对冻融过程较为敏感，反复冻融会明显降低病毒滴度（每冻融一次，病毒滴度降低10%），冻融3次以上衰减效应会显著加剧。分装的核心目的就是避免反复冻融，保证实验数据的稳定性与可重复性。

1. 准备工作：需超净台内无菌操作，所有耗材（无菌EP管、枪头）提前预冷，预先标记每个分装管，标注病毒类型、滴度、体积、日期等关键信息。

2. 分装体积：按单次实验用量分装，如5 μL/管、10 μL/管、20 μL/管，避免大体积包装反复取用。

3. 操作细节：全程冰上操作；分装前短暂低速离心，将管壁、管盖的残留液体全部收集至管底；吸取时缓慢操作，避免产生气泡。

4. 封口防护：分装完成后盖紧管盖，用封口膜密封管口，防止冰箱内结霜污染与溶剂挥发。

不同储存条件

1. 若不立即使用，-80℃恒温冰箱可保存1-2年，如果病毒储存时间超过6个月，建议在使用前重新测定滴度以确保实验效果。

2. 若立即使用，可放4℃冷藏，建议一周内用完。

3. 不推荐-20℃保存，冰晶会损伤病毒衣壳，导致滴度大幅下降。

在上述相关操作规范下：

1. 取分装后的单管病毒，置于冰上缓慢完全融化，短暂低速离心后备用；

2. 按计算量吸取预冷稀释液（如无菌PBS缓冲液、无菌生理盐水等），加入预冷且标记好的无菌EP管中；

3. 吸取病毒原液的枪头没入稀释液液面以下，缓慢打出病毒，避免直接冲击产生气泡；

4. 用枪头轻柔吹打3-5次混匀，吹打过程中枪头始终保持在液面以下，避免吸入空气产生气泡；

5. 短暂离心收集管壁液体，置于冰上待用。

（注：稀释后的工作液必须现配现用，剩余液体不建议再次冻存使用。）