IF=22.9【AAV在心脏疾病中的应用】USP18“刹车”线粒体自噬，PTEN‑L是“帮凶”——武汉大学中南医院团队揭示心肌I/R损伤新靶点

急性心肌梗死（AMI）由冠状动脉突发阻塞引发心肌缺血所致，若未及时恢复冠脉灌注，会进展为心肌瘢痕化与不良心脏重构，最终诱发心力衰竭。经皮冠状动脉介入治疗（PCI）是AMI的初始治疗，可快速重建冠脉血流，但再灌注过程会诱发一系列细胞损伤，甚至可能抵消血运重建的获益，目前临床仍无有效手段防治缺血/再灌注（I/R）损伤。深入研究再灌注损伤机制可为AMI研发新疗法，助力提升病患预后。

维持线粒体稳态是细胞生理功能正常运转的关键，线粒体自噬作为清除受损、异常或功能失调线粒体的核心机制，其功能异常与心肌I/R损伤的发生发展密切相关。恩格列净（SGLT2抑制剂）通过激活线粒体自噬，对心脏微血管I/R损伤提供保护作用。因此，靶向线粒体稳态与线粒体自噬已成为干预心肌I/R损伤的潜在方向。PINK1（PTEN诱导激酶1）-Parkin轴是经典的线粒体自噬调控通路，线粒体去极化促使PINK1在线粒体外膜蓄积、募集Parkin，后者泛素化线粒体外膜蛋白，最终启动线粒体自噬清除。研究表明，PINK1-Parkin通路在心肌I/R损伤中发挥保护作用。磷酸酶和张力蛋白同源物长亚型（PTEN-L）通过蛋白磷酸酶活性使泛素结合物去磷酸化发挥其作用，被证实是Parkin介导线粒体自噬的新型负向调控因子。因此，靶向PTEN-L-Parkin-线粒体自噬通路具备治疗心肌I/R损伤的潜力。

泛素化与去泛素化修饰在线粒体稳态调控中占据核心地位，尤其是在心血管疾病和心肌I/R损伤等病理条件下。多种去泛素化酶，包括泛素特异性蛋白酶（USP）30、USP33和USP35，已被证实参与心肌细胞线粒体自噬的调控。USP18既往研究主要聚焦于其在炎症、抗病毒信号及肿瘤进展中的作用，近期研究发现其可缓解主动脉缩窄诱导的病理性心脏重构，提示该分子可能参与心肌I/R损伤的调控，但USP18在心肌I/R损伤中的具体功能，以及其调控线粒体自噬的分子机制尚未明确。

基于上述临床问题与研究空白，本研究旨在明确USP18是否通过调控线粒体自噬参与心肌I/R损伤过程，并深入解析其潜在分子机制，以期为心肌I/R损伤的防治提供新的潜在治疗靶点。2026年3月24日，武汉大学中南医院心血管内科主任医师鲁志兵、胡笑容在Military Medical Research（IF=22.9）发表题为“USP18 exacerbates myocardial I/R injury by inhibiting Parkin mitophagy through the deubiquitinase PTEN-L”研究论文。USP18在I/R损伤后的小鼠心脏组织及缺血性心脏病（IHD）患者心脏组织中表达均上调。心肌特异性USP18缺失可缓解I/R诱导的急性心肌损伤、线粒体功能障碍及不良心脏重构，而USP18过表达则会加重上述病理改变。机制上，USP18与PTEN-L结合，PTEN-L进一步结合Parkin并抑制其磷酸化及线粒体转位，最终抑制线粒体自噬。Parkin敲低可消除USP18缺失带来的心脏保护作用，而PTEN-L敲低则可逆转USP18过表达的损伤效应。此外，PTEN-L还可通过旁分泌机制发挥致病作用，使用中和抗体阻断PTEN-L可减轻心肌I/R损伤。ST段抬高型心肌梗死（STEMI）患者（尤其是介入治疗后）血清PTEN-L水平显著升高。综上所述，USP18通过PTEN-L-Parkin轴抑制线粒体自噬，并加重心肌I/R损伤，该机制涉及细胞内和旁分泌途径。靶向USP18-PTEN-L通路有望成为减轻心肌I/R损伤的新型治疗策略。

1.心肌I/R损伤可诱导USP18表达

为探寻心肌I/R损伤的关键调控分子，研究对I/R处理（左前降支（LAD）缺血45分钟后再灌注）24小时的小鼠左心室（LV）组织进行基因表达谱分析，GO功能富集分析提示差异基因显著富集于泛素介导的蛋白调控通路；进一步对泛素相关差异表达基因筛选后，共鉴定出14个上调基因与2个下调基因，其中USP18在I/R心脏中的上调趋势最为显著。临床样本检测发现，IHD患者病变心肌组织中USP18蛋白表达明显升高；重新分析终末期IHD患者心脏RNA测序数据集GSE203160，也印证了这一上调趋势。动物实验表明，小鼠心肌I/R损伤后24小时至4周内，USP18表达逐渐增加。USP18与小麦胚芽凝集素（WGA标记心肌细胞膜）的双重免疫荧光染色显示，正常心肌组织中USP18本底表达极低，I/R损伤后表达显著升高，且主要定位于心肌细胞，而心肌成纤维细胞、内皮细胞及巨噬细胞中的USP18表达水平，在I/R应激下未见变化。

体外原代新生大鼠心室肌细胞（NRVM）实验同样证实，缺氧/复氧（H/R，细胞在95% N₂、5% CO₂中缺氧4小时，再换至95%空气、5% CO₂中复氧过夜）损伤可在6、12、24小时时间点显著诱导USP18表达，且该蛋白主要定位于细胞质。综上，体内外结果一致表明心肌I/R损伤可诱导USP18表达。

进一步探究USP18的表达调控机制发现，在NRVM的H/R模型中，TNF-α及心肌梗死关键炎症介质HMGB1（高迁移率族蛋白）可通过转录水平正向调控USP18表达，是介导急性心肌I/R损伤诱导USP18上调的重要上游炎症因子。

图1.心肌I/R损伤可诱导USP18表达

2.USP18缺失减轻小鼠体内线粒体功能障碍、急性心肌I/R损伤及心脏重构

为明确USP18在心肌I/R损伤中的作用，作者构建了心肌特异性USP18条件性敲除（USP18-cKO）小鼠。结果发现，与野生型（WT）相比，USP18-cKO小鼠在相同手术处理后，I/R损伤后的梗死面积更小；术后4小时血清cT-nT、CK-MB和LDH水平均显著降低，表明心肌损伤得到缓解。USP18缺失使LV组织DNA碎片化减少、cleaved caspase-3活性下降，提示I/R损伤后细胞总凋亡减少。

随后评估线粒体形态和功能。结果显示，USP18-cKO小鼠表现出线粒体DNA含量增加，线粒体复合物Ⅰ和Ⅱ-Ⅲ活性改善；I/R诱导的线粒体丢失和嵴排列紊乱得到缓解，线粒体结构得以维持。此外，USP18敲除也减轻了I/R诱导的线粒体功能障碍，表现为耗氧率（OCR）升高，基础呼吸、ATP相关呼吸和最大呼吸水平均升高，而备用呼吸无显著差异。

为进一步探究USP18对生理条件下心功能的长期影响及对I/R后心脏重构的作用，作者延长了观察时间。USP18-cKO小鼠在2、4、6和12月龄时心功能与WT同窝对照相当。与WT相比，USP18-cKO小鼠心肌细胞增大程度更轻，LV纤维化重构减轻，心重/胫骨长比（HW/TL）降低。I/R后4周，USP18-cKO心脏中肥大和纤维化标志物（包括心房钠尿肽（ANP）、B型钠尿肽（BNP）以及胶原Ⅰ和Ⅲ）的转录激活被显著抑制。I/R后USP18-cKO小鼠心功能改善、心室扩张减轻，表现为左心室射血分数（LVEF）和左心室短轴缩短率（LVFS）升高，同时舒张期左心室内径（LVIDd）、收缩期左心室内径（LVIDs）及心率降低。总体而言，心肌特异性敲除USP18揭示了USP18在小鼠心脏中对线粒体破坏、急性I/R诱导的心肌损伤及长期不良心室重构具有致病性贡献。

图2.USP18缺失可减轻小鼠体内线粒体功能障碍、急性心脏I/R损伤及心脏重构

3.心肌USP18过表达对线粒体功能及缺血后重构的病理性影响

为探究USP18过表达是否会加重上述病理改变，作者在I/R术前两周经尾静脉向C57BL小鼠单次注射AAV9-USP18，使其心脏组织中USP18呈高表达。USP18过表达（USP18-OV）小鼠在I/R术后24小时梗死面积增大、LV组织DNA碎片增加，术后4小时血清cTnI、CK-MB和LDH水平升高。此外，心肌过表达USP18显著加重了线粒体功能障碍：I/R小鼠线粒体密度降低、嵴排列紊乱加重、线粒体DNA含量减少，复合物Ⅰ和Ⅱ-Ⅲ活性下降；同时细胞OCR降低，基础、最大和备用呼吸均受抑制。

生理状态下，USP18-OV小鼠从6月龄起心功能下降，至12月龄时更为明显。I/R术后4周，USP18-OV小鼠出现明显的心脏重构，表现为心肌细胞肥大、纤维化区域扩大、HW/TL升高，心肌肥厚与纤维化标志物的mRNA转录水平也升高；超声提示LVEF和LVFS降低，LVIDd、LVIDs及心率均恶化。总之，这些发现表明，心肌特异性过表达USP18会加重I/R后心脏的线粒体功能障碍、急性缺血性损伤以及后续的结构和功能恶化。

体外H/R模型进一步证实，采用腺病毒过表达USP18可加重心肌细胞损伤及线粒体功能障碍，而采用siRNA沉默USP18则减轻上述改变。

图3.心肌过表达USP18会加重小鼠I/R后的线粒体功能障碍、急性心肌损伤及心脏重构

4.USP18通过调控线粒体功能并抑制线粒体自噬，加剧心肌I/R损伤

为明确USP18的作用，研究者对I/R后24小时的USP18-cKO和WT小鼠心脏进行了RNA-seq。KEGG分析显示，I/R后USP18缺失心脏中最显著富集的通路是代谢调控和线粒体自噬；热图表明USP18-cKO显著调控了线粒体活性和代谢相关基因的表达。GSEA进一步证实，USP18缺失显著上调了线粒体相关的GO通路。

敲除和过表达实验均证实USP18影响线粒体功能。线粒体功能障碍是心肌I/R损伤的核心环节，而线粒体自噬受损会加速这一过程，提示USP18可能通过调控线粒体自噬参与I/R损伤。

透射电镜显示，I/R小鼠心脏中线粒体自噬受损，而在USP18-cKO心脏中得到恢复。I/R损伤后，线粒体中PINK1、Parkin、P62、LC3Ⅱ和泛素化蛋白（Ub）水平升高；与WT相比，USP18-cKO小鼠上述蛋白水平更高，而USP18-OV小鼠则更低。

体外实验用线粒体自噬和溶酶体双荧光染料检测发现：红色标记自噬线粒体、绿色标记溶酶体；当自噬体与溶酶体融合后，进入酸性环境的红色荧光增强，反映自噬流活性。结果显示，敲低USP18后自噬流增强，过表达则减弱。USP18敲低使NRVM线粒体中PINK1、Parkin、Ub、P62和LC3Ⅱ水平升高，过表达则降低。进一步证实USP18通过抑制PINK1/Parkin介导的线粒体自噬，在I/R损伤中发挥有害作用。

此外，USP18敲除或过表达并不改变线粒体裂变（p-Drp1）、融合（MFN1/2）、生物发生（PGC-1α、TFAM）及其他自噬受体（BNIP3、FUNDC1）的水平，说明USP18主要选择性抑制PINK1/Parkin通路，而非全面破坏线粒体质量控制。与此一致，USP18可上调凋亡蛋白Bax/Bcl-2，这一效应在敲除后被抑制。同时，H/R应激下敲低USP18可降低线粒体活性氧（ROS）水平，过表达则升高（线粒体清除增强可能是ROS减少的原因）。此外，USP18-cKO小鼠I/R后促炎因子（TNF-α、IL-1、IL-6）水平也降低。

综上，USP18主要通过抑制线粒体自噬来影响线粒体功能，进而调控健康线粒体数量、呼吸功能、氧化应激和凋亡。

图4.USP18通过调控线粒体功能并抑制线粒体自噬，加剧心肌I/R损伤

5.心肌特异性敲降Parkin会加重USP18-cKO小鼠的急性心肌I/R损伤

为验证USP18是否通过抑制线粒体自噬来加重心肌细胞损伤，在USP18敲低的NRVM中进一步敲低Parkin（或使用抑制剂Mdivi-1）阻断线粒体自噬，结果逆转了USP18沉默对H/R损伤的保护作用（细胞活力下降、LDH释放增加、DNA碎片化、cleaved caspase-3活性升高及线粒体功能障碍）。

与体外实验结果一致，在体内敲低Parkin会加重USP18-cKO小鼠的急性I/R损伤。而且，Parkin敲低显著逆转了USP18敲除对线粒体功能障碍和线粒体自噬失衡的保护作用。此外，USP18-cKO对I/R术后4周不良心脏重构和心功能障碍的保护效应，也在Parkin敲低后被消除。这些体内外实验共同表明，线粒体自噬受损是USP18介导心肌I/R损伤的关键环节。

图5.小鼠体内敲低Parkin可抵消USP18缺失的保护作用

6.USP18通过去泛素化上调PTEN-L表达，进而抑制线粒体自噬降解，加剧心肌I/R损伤

为寻找USP18调控线粒体自噬的下游靶点，研究者用免疫共沉淀（Co-IP）联合质谱筛选心肌细胞中与USP18相互作用的蛋白，结果PTEN第一。但后续发现USP18并不调控经典PTEN，而是调控其长亚型PTEN-L：在USP18-cKO心脏和敲低USP18的NRVM中，PTEN-L蛋白水平下降；在USP18过表达（腺病毒或AAV）时，PTEN-L水平升高，而PTEN不变。

Co-IP证实USP18与PTEN-L直接结合，且I/R或H/R处理后两者内源性结合增强。Pull-down实验进一步定位，USP18的1-109 aa和299-368 aa片段与PTEN-L的ATR结构域有强结合。进一步机制表明，USP18通过去泛素化PTEN-L（主要抑制K48链泛素化）来延长其半衰期（放线&菌酮实验证实），从而稳定PTEN-L。

已知pSer65-Ub可招募Parkin至线粒体，而PTEN-L能使pSer65-Ub去磷酸化，从而降低线粒体上的pSer65-Ub水平。本研究发现，在USP18-cKO小鼠心脏及敲低USP18的NRVM中，线粒体pSer65-Ub水平升高；在USP18-OV小鼠或过表达USP18的NRVM中则降低。此外，Co-IP显示PTEN-L与Parkin存在结合，且USP18过表达增强二者结合，敲低则减弱。功能上，PTEN-L抑制Parkin向线粒体转位（亚细胞分离实验），并降低Parkin磷酸化水平（Phos-tag实验）。综上，USP18通过稳定PTEN-L，使其与Parkin结合，进而抑制Parkin的磷酸化和线粒体转位，最终阻断线粒体自噬，加重I/R损伤。

为验证USP18的有害作用是否依赖其去泛素化酶活性，研究者构建了去泛素化失活的USP18突变体（C61A）。结果显示，过表达野生型USP18可加重H/R诱导的线粒体功能障碍和细胞损伤，而C61A突变体无此作用。同样，为验证PTEN-L是否需要其磷酸酶活性，构建了磷酸酶失活的PTEN-L突变体（C297S），发现野生型PTEN-L加重损伤，而C297S无作用。功能回复实验进一步证实了上下游关系：在USP18过表达的NRVM中敲低PTEN-L（siRNA），可减轻损伤，说明USP18的有害作用依赖于PTEN-L；反之，在USP18敲低的NRVM中过表达PTEN-L（腺病毒），损伤仍加重，表明PTEN-L可独立于USP18起有害作用。体内同样用AAV9-shPTEN-L特异性敲低心肌中的PTEN-L，结果减轻了急性I/R损伤、线粒体功能障碍、线粒体自噬失衡以及远期心脏重构和心功能下降；而且，在PTEN-L敲低背景下，USP18过表达不再加重这些病理改变。

综上，USP18通过去泛素化稳定PTEN-L，PTEN-L通过其磷酸酶活性抑制Parkin的转位和磷酸化，从而阻断线粒体自噬，最终加剧心肌I/R损伤。

图6.USP18通过去泛素化上调PTEN‑L，从而抑制线粒体自噬降解，加重心脏I/R损伤

7.抗PTEN-L抗体对心脏I/R损伤具有体内保护作用

PTEN-L是一种分泌蛋白，可在血清中检测到。I/R处理后，小鼠血液中PTEN-L水平升高；USP18-OV小鼠更高，USP18-cKO小鼠更低。细胞实验同样显示，过表达USP18使细胞上清中PTEN-L升高，敲低USP18则降低。

PTEN-L通过其ATR结构域介导分泌。当ATR结构域突变后，细胞上清中几乎检测不到PTEN-L，且该突变体不再加重H/R诱导的线粒体功能障碍和细胞损伤。此外，使用抗PTEN-L抗体（I/R术后小鼠隔天注射抗体，共28天），无论体外还是体内，均可减轻H/R或I/R损伤（改善线粒体功能、自噬失衡、心脏重构和心功能）。

临床数据显示，STEMI患者血清PTEN-L水平升高，PCI术后即刻进一步升高，且PTEN-L水平与LVEF、LVFS呈负相关。

综上，I/R上调心脏USP18，USP18稳定PTEN-L，后者抑制Parkin通路及线粒体自噬，并通过旁分泌放大损伤。靶向USP18-PTEN-L轴可恢复自噬、保护心脏。

图7.抗PTEN‑L抗体能减轻小鼠体内心脏I/R损伤