【客户文章】《Nature neuroscience》VTA中GABA能和谷氨酸能神经元对觉醒和睡眠的调节机制

睡眠，是人体自我调节的关键方式，是生命维持的重要的一环。但是睡眠这一现象的成因却并未解开，近日，董海龙课题组在《Nature neuroscience》发表文章“GABA and glutamate neurons in the VTA regulate sleep and wakefulness”揭示了VTA区GABA能和谷氨酸能神经元对睡眠与觉醒的调控机制，并在封面报道。

课题组首先对Vglut2-ires-Cre小鼠的整个下丘脑后脑区(PH MB)使用化学遗传学病毒AAV-DIO-hM3Dq-mCherry进行侵染，并用CNO与生理盐水注射作为对照及实验组，实验结果发现，在对下丘脑后脑区全体化学遗传激活的小鼠觉醒的时间延长了12小时，为了进一步阐明机理，课题组对其中各个核团分别进行化学遗传学研究，最终发现，当激活LH以及VTA核团时，小鼠的的觉醒时间也出现延长现象。

为了进一步验证VTA中谷氨酸能神经元与小鼠睡眠的关系，课题组使用AAV-DIO-taCASP3-TEV使VTA中80%以上的谷氨酸能神经元失活，然后将失活的 VTAVglut2-CASP3 小鼠与对照小鼠进行熄灯睡眠实验，结果显示 VTAVglut2-CASP3小鼠较对照组在“熄灯”状态下更多次觉醒，但每次觉醒持续的时间下降。接下来课题组利用Ca+探针病毒AAV-DIO-GCaMP6观察TVA中谷氨酸能神经元在不同状态下的活动情况，发现该类神经元在觉醒和快速眼动睡眠时表现为兴奋状态，而在非快速眼动睡眠时沉默，课题组根据这一结果推测TVA中谷氨酸能神经元的功能不仅能依靠兴奋导致觉醒，而且可以维持觉醒状态。

接下来为了阐述VTA中谷氨酸能神经元促进觉醒的机制，课题组使用光遗传病毒AAV-DIO-ChR2-EYFP对VTA中谷氨酸能神经元进行感染，发现该类神经元下游主要投射于NAc和LH核团，在这两个核团使用光纤进行光刺激会使原本进入睡眠的小鼠立刻觉醒，当光刺激消失时，小鼠又会回到原状态。这一实验证实了VTA中谷氨酸能神经元正是通过在NAc和LH核团的投射参与到觉醒的调控中。

下面课题组将目光转向VTA中的另一类GABA能神经元，课题组在 Vgat-ires-Cre 小鼠的 VTA 中分别感染AAV-DIO-hM3Dq-mCherry 或AAV-DIO-hM4Di-mCherry，对该类神经元进行化学遗传学调控，并对其觉醒状况进行记录，经过研究，课题组发现VTA中的GABA能神经元展现出与谷氨酸能神经元截然相反的特性——当VTA中的GABA能神经元激活时，更多的小鼠处于睡眠状态，而抑制GABA能神经元时则全部小鼠都处在了觉醒状态。

紧接着，课题组通过注射AAV-DIO-taCASP3-TEV失活了大部分VTA中的GABA能神经元，构建了VTAVgat-CASP3 小鼠，并将其与注射对照病毒的小鼠的睡眠觉醒进行比较，结果发现VTAVgat-CASP3小鼠不仅更多的维持在了觉醒状态，且在睡眠的小鼠中进入快速眼动睡眠的比例也有所增多。接下来，课题组对处在觉醒、快速眼动睡眠和非快速眼动睡眠这3种状态下的小鼠，使用GCaMP探针对其神经元进行钙离子浓度变化的追踪结果显示，在三种状态下，小鼠VTA中GABA能神经元的钙离子浓度变化差异较小，没有谷氨酸能神经元明显。

课题组进一步就该类神经元的进行探索，使用光遗传学病毒AAV-DIO-ChR2-EYFP注射于Vgat-ires-Cre 小鼠VTA中，发现该类神经元仅投射于LH核团中，对LH核团进行光纤刺激时，小鼠会很快进入睡眠状态，失去刺激后小鼠又逐渐开始清醒，可见VTA中的GABA能神经元正是通过投射到LH的方式对睡眠和清醒进行反向调控的。

董老师课题组的研究主要发现了VTA区非dopaminergic神经元对睡眠觉醒的调控作用，主要为glutamate神经元自身及其下游向LH和NAc的投射对觉醒的调控，以及VTA区GABA神经元通过抑制LH区调控觉醒的Orexin神经元，从而达到促进睡眠的作用，阐述了VTA区作为睡眠和觉醒的重要调节中枢。而VTA区作为中脑的重要脑区，接受来自各个脑区GABA和glutamate神经元的信号输入。本文的第一作者为英国帝国理工大学喻晓博士，共同第一作者为空军军医大学西京医院李文硕士，这一研究在国家自然科学基金委国际（地区）合作项目（81620108012）的支持下完成，为后期在VTA区的奖赏、成瘾及社会等级等必须在清醒状态下完成的研究提供了强有力的参考依据。

董老师课题组实验的成功，除了巧妙的构思和刻苦的钻研实践之外，工具病毒也为他们提供了强而有力的援助。光遗传/化学遗传病毒、神经元失活病毒、轴突定位钙成像病毒等多种病毒在整个实验中精确而高效的表达，准确的完成了光激活、化学激活、化学抑制、神经失活以及钙离子浓度实时追踪等多种实验要求，达到实验目的。文中的轴突定位钙成像病毒AAV2/9-CAG-DIO-GCaMP6f正是来自枢密科技，工具从来都是人类征服更高要求，达到更高水平的桥梁，正所谓“工欲善其事，必先利其器”，选择枢密将为您探索生命科学研究提供澎湃动力！

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