【客户文章】 腹外侧中脑导水管周围灰质中GABA能神经元的抑制和谷氨酸能神经元的激活参与大一麻素受体1介导的电针镇痛

电针镇痛效应目前已经在世界范围内得到了广泛认可，但其在中枢神经系统的确切靶点和细胞特异性的镇痛机制仍然没有得到充分的认识。一系列有关于针刺和镇痛的研究表明，针刺对慢性痛，如膝关节痛、腰痛、偏头痛、纤维肌痛等有良好的镇痛效果［1-3］。由于电针镇痛在中枢神经系统中的特异性靶点仍不明确，极大地阻碍了电针镇痛的临床应用和推广。

已有研究证实，电针可以诱导c-fos在中脑导水管周围灰质（periaqueductal gray, PAG）中特异性表达［4］，腹外侧中脑导水管周围灰质(ventrolateral periaqueductal gray, vlPAG)是介导疼痛调节的神经通路的重要组成部分［5］。

内源性镇痛物质阿一片肽和大一麻素通过间接抑制局部GABA能中间神经元的抑制效应来激活下行通路，因此使输出神经元对脊髓的痛觉信息传递产生去抑制作用［6］。内源性大一麻素系统是中枢神经系统中控制疼痛传导和针刺镇痛的重要神经调节系统，其介导的抗伤害作用在下行抑制性镇痛通路的激活中起到重要作用［7-8］。

vlPAG中的GABA能神经元和谷氨酸能神经元在伤害性信息处理中起着重要而又复杂的作用。在vlPAG中微量注射谷氨酸激动剂或GABA拮抗剂可以产生显著的抗伤害性刺激效应［9,10］。大一麻素受体1(Cannabinoid receptor 1, CB1)在PAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元的神经末梢均有表达，CB1受体的激活可能调节GABA能和谷氨酸能神经元的传递［11-12］。之前的研究结果表明，CB1受体参与电针镇痛［13］。那么vlPAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元是否参与CB1受体介导的电针镇痛呢？

2019年5月17日，华中科技大学同济医学院神经生物学系李熳团队在《Frontiers in Neuroscience》上在线发表了题为“Inhibition of GABAergic Neurons and Excitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor”的文章。在本研究中发现，电针通过CB1受体抑制vIPAG中GABA能神经元和激活谷氨酸能神经元而发挥镇痛作用，vIPAG中GABA能神经元上的CB1受体是电针镇痛的重要靶点。本研究为电针能够通过CB1受体双向调控vIPAG中的GABA能神经元和谷氨酸能神经元而产生镇痛效应的机制提供了新的实验证据。

 

首先，团队对小鼠采用与大鼠坐骨神经慢性损伤（CCI）［14］类似的方法，使其产生神经病变来制备CCI模型；采用左膝关节内注射碘一酸单钠（MIA）来诱导膝骨关节炎（KOA）模型。通过电针治疗CCI和KOA小鼠，发现电针显著增加其机械痛阈值和热痛阈值（图1A-D）。并且在条件性位置偏爱实验中，小鼠在与电针治疗进行条件性配对后，逗留在明箱的时间显著增加（图1E-H）。

Figure 1. EA effectively reduces pain hypersensitivity in CCI and KOA mice.
 

课题组为了验证抑制vlPAG中的GABA能神经元是否可以发挥镇痛作用。应用了化学遗传学策略，将rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gi)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG的右侧，目的是特异性的抑制GABA能神经元的活动 (图 2A)。这种病毒混合物同样注射到GAD67-GFP小鼠的右侧vlPAG区，用来验证病毒的转染效率(图2B, C)。vlPAG中约有80.5%标记上的神经元和GAD67-GFP阳性神经元共定位(图 2D)。

随后，化学遗传抑制CCI和KOA小鼠GABA能神经元，能有效地模拟电针的效应，包括镇痛效应(图3A–H).

Figure 3. Chemogenetic inhibition of GABAergic neurons in the vlPAG replicated the effects of EA.

 

接下来，为了验证激活GABA能神经元是否能翻转电针的镇痛的效应。团队将rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒和rAAV-hSyn-DIO-hM3D(Gq)-mCherry-WPRE-pA病毒混合物注射到CCI和KOA小鼠vlPAG中以达到激活GABA能神经元的目的。

意外地发现，激活vlPAG中GABA能神经元后只能部分降低电针治疗组小鼠的机械痛阈值和热痛阈值(图 4A-D)，同时也只能部分降低条件性位置偏爱实验中小鼠待在明箱的时间（图4E-H）。

Figure 4. Chemogenetic activation of GABAergic neurons in the vlPAG only partly attenuated the effect of EA.
 

单独激活GABA能神经元只能部分的减弱电针的镇痛效应，为了验证GABA能神经元和谷氨酸能神经元都参与了电针的镇痛效应。

研究团队在vlPAG中GABA能神经元被激活的基础上，另外使用rAAV-CaMKIIa-HA-KORD-IRES-mCitrine-WPRE-pA病毒来选择性抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元的活动。发现激活vlPAG中的GABA能神经元并抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元可以大幅降低小鼠的机械缩腿阈值和热痛阈值(图5A-D)，以及在条件性位置偏爱实验中明箱逗留的时间(图 5E-H)。

接下来，为了验证vlPAG中GABA能和谷氨酸能神经元的轴突上表达的CB1受体是否参与电针的镇痛作用。我们在mCnr1^flox/flox小鼠右侧vlPAG中注射了rAAV-mDlx-CRE-WPRE-pA病毒，特异性敲除vlPAG中GABA能神经元上的CB1受体；在mCnr1^flox/flox小鼠右侧vlPAG中注射rAAV-CaMKII-CRE-WPRE-pA病毒，特异性敲除vlPAG中谷氨酸能神经元上的CB1受体(图6A, C)。

实验发现，特异性敲除GABA能神经元上的CB1受体可以消除电针的镇痛效应，显著降低了机械痛阈值和热痛阈值(图 7A-D)以及在条件性位置偏爱实验中明箱的逗留时间（图7E-H）。特异性敲除vlPAG中谷氨酸能神经元上的CB1受体仅轻微地减弱电针的镇痛效应。结果表明，vlPAG中位于GABA能神经元上的CB1受体才是电针发挥镇痛效应的基础。

Figure 6. Specific knockout of the CB1 receptor on GABAergic neurons localized in the vlPAG.

Figure 7. Specifically knocking out CB1 receptor of GABAergic neurons abolished the EA effect on pain hypersensitivity.
 

在这项研究中，运用化学遗传策略中所用的病毒工具均来自枢密科技。证明了vlPAG中GABA能神经元和谷氨酸能神经元在电针镇痛效应中新的机制，即电针可以通过CB1受体同时抑制vlPAG中GABA能神经元和激活vlPAG中谷氨酸能神经元来发挥镇痛效应。特异性敲除GABA能神经元上的CB1受体能够完全消除电针的镇痛效应，而只有激活vlPAG中的GABA能神经元联合抑制vlPAG中的谷氨酸能神经元才能够完全翻转电针的镇痛作用。电针能够通过CB1受体在GABA能系统和谷氨酸能系统上同时发挥不同的调节功能。这项研究可能为临床疼痛治疗和镇痛药物的发展提供了一个新的思路。

参考文献

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原文链接：Inhibition of GABAergic Neurons and Excitation of Glutamatergic Neurons in the Ventrolateral Periaqueductal Gray Participate in Electroacupuncture Analgesia Mediated by Cannabinoid Receptor

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