IF=17.521【客户文章】Adv Sci：北京大学基础医学院王韵教授团队揭示痛觉表观调控新机制，并开发新型镇痛药

 

         DRG感觉神经元具有多种形态和功能特征以区分不同类型的感觉。如具有大胞体的DRG神经元负责本体感受和机械性感受，而胞体较小的神经元则是传递疼痛信号的伤害性感受器。为探究CDYL在初级感觉神经元中的作用，研究人员首先评估了CDYL在小鼠DRG中的细胞分布。免疫染色结果显示CDYL在不同大小的DRG神经元的细胞核中普遍表达。定量分析表明，93.95%的异亮氨酸B4（IB4）阳性神经元，91.98%的降钙素基因相关肽（CGRP）阳性神经元和93.10%的神经丝蛋白200（NF200）阳性神经元分别表达CDYL。

图1. CDYL在DRG神经元中普遍表达
 

2.DRG中CDYL功能丢失增加疼痛阈值

         基于外周伤害性感受器中CDYL的表达，作者推测CDYL可能有助于疼痛处理。western blot分析表明，同侧腰椎4-5（L4-5）DRG中的CDYL表达在保留性神经损伤（SNI）后第14天和第21天升高。免疫染色证实了SNI后第14天观察到的CDYL表达增加。为进一步确定CDYL在疼痛病因中的作用，研究人员鞘内注射CDYL-shRNA质粒以敲低小鼠DRG中内源性CDYL表达。通过western blot验证了CDYL敲低效率。小鼠鞘内注射CDYL-shRNA后第2天基线热痛（辐射热）和机械痛（von Frey测试）阈值显著提高。CDYL的敲低减轻了由外周神经损伤引起的机械性痛觉超敏。为证实CDYL对疼痛处理的贡献，使用Cre-Loxp重组系统形成条件性Cdyl敲除小鼠。而由于小鼠Cdyl全身敲除导致胚胎致死，于是作者构建了两种类型的DRG条件性Cdyl敲除（cKO）小鼠。其一通过纯合Cdyl-floxp（Cdyl^F/F）小鼠与Na_v1.8-Cre小鼠系（Na_v1.8^Cre）杂交删除DRG伤害性感受器中的Cdyl。其二通过Cdyl^F/F小鼠与Prrxl1他莫昔芬诱导的Cre（Prrxl1^CreERT2）小鼠系杂交删除DRG神经元中的Cdyl。Na_v1.8^CreCdyl^F/F和Prrxl1^CreERT2Cdyl^F/F小鼠的敲除效率分别通过RT-PCR和western blot进行了验证。行为学测试结果表示正常状态下，Cdyl缺陷小鼠对伤害性机械和热刺激的敏感性减弱。与此一致的是，SNI诱导的疼痛超敏反应因Cdyl的缺失显著减轻。总的来说，这些发现有力地证明了CDYL是伤害性感受信号通路所必需的。

3. DRG中CDYL功能丢失抑制神经元兴奋性

         组织炎症或损伤导致DRG的敏感或过度兴奋，最终造成疼痛。正如前人研究报道，CDYL可以抑制海马和皮层神经元的兴奋性，研究人员进行了电生理实验，以测试是否Cdyl缺陷也影响初级感觉神经元的内在电特征。令人惊讶的是，与对照组相比，雄性Cdyl cKO（Prrxl1^CreERT2Cdyl^F/F）小鼠静息膜电位（RMP）明显降低了4.15 mV。相比于对照组，雄性Cdyl cKO小鼠的动作电位（AP）阈值、电流阈值和后超极化（AHP）幅度分别增加了52.36%、63.46%和14.12%。由100–300 pA电流诱发的APs的平均数量因删除Cdyl而明显减少。综上所述，这些结果表明，与对中枢神经系统的影响相反，CDYL功能缺失降低了DRG中神经元的兴奋性。

         为探索CDYL调节伤害性感受的分子机制，研究人员通过染色质免疫沉淀（ChIP）结合二代DNA测序（ChIP-seq）在小鼠DRG中鉴定了下游基因。结果显示存在10895个CDYL特异性结合峰，下一步基因组位置偏好分析表明，31.6%的结合位点位于远端启动子区域，36.7%位于外显子区域，11.9%位于内含子区域，8.4%位于启动子区域。利用CDYL结合基因组位置的GO分析，以鉴定相关基因涉及的生物学过程。结果表示主要与神经系统功能有关。利用DRG组织进行ChIP-qPCR分析验证ChIP-seq结果。研究人员选择14个与神经功能相关的基因，包括Kcnb1、Npas4和Nsf。结果表明，CDYL在所选基因的相应结合位点富集。考虑到CDYL是转录辅抑制因子，测定了Cdyl cKO小鼠DRG中所选基因的mRNA水平。结果表明，这些基因的mRNA水平在Cdyl cKO小鼠中显著升高，进一步支持ChIP-seq结果。在这些候选基因中，Kcnb1/K_v2.1（延迟整流型钾通道）mRNA和蛋白水平在神经损伤后第7、14、21天显著降低，表明K_v2.1通道是CDYL介导伤害性感受的潜在下游。而前人报道CDYL通过促进H3K27me2/3和H3K9me2/3修饰或募集HDAC1/2来抑制转录。因此，作者推测CDYL通过改变组蛋白甲基化或染色质乙酰化水平来调节K_v2.1的表达。首先，ChIP-seq结果表明CDYL与Kcnb1的内含子元件结合，并通过ChIP-qPCR证实了结合位点（+897至+1143 bp）。此外，研究人员使用抗H3K27me3、H3K9me2、H3K9me3和H3K27ac的抗体进行了ChIP-qPCR。结果提示相对于对照组，在Cdyl cKO小鼠DRG中观察到H3K27me3水平降低，但其他标志物水平保持相对不变。Western blot分析证实，Cdyl缺乏增强了外周K_v2.1的表达。此外，SNI模型中Kcnb1基因的H3K27me3水平增加，进而导致神经病理性疼痛下K_v2.1表达下降。总之，上述这些结果表明CDYL通过在Kcnb1内含子区域招募H3K27me3来转录沉默K_v2.1。

         K_v2.1通道是众所周知的神经元兴奋性抑制剂，特别是当高频AP放电发生时，并在各种超兴奋状态下发挥神经保护作用。接下来，研究了Cdyl的缺失是否会影响钾电流。应用全细胞电压钳记录急性分离的DRG神经元的K_v电流。结果表明，CDYL缺失增加了总K_v和K_v2.1电流密度。这些发现表明CDYL抑制总K_v和K_v2.1电流，从而维持DRG神经元的兴奋性。

6. CDYL通过K_v2.1通道调节伤害性感受

         进一步评估外周CDYL-K_v2.1信号轴功能障碍的病理生理后果，Cdyl cKO小鼠的单侧L4-5 DRG中注射AAV-K_v2.1-shRNA-EGFP或AAV-scramble-shRNA-EGFP，同窝出生小鼠作为对照组。如western blot所示，病毒注射后4周K_v2.1-shRNA感染组K_v2.1表达显著下调（表明敲低效率可以）。K_v2.1-shRNA感染的cKO小鼠比scramble-shRNA感染cKO小鼠表现出更剧烈的机械和热伤害性感受反应。此外，K_v2.1-shRNA感染的cKO小鼠在SNI后出现更严重的超敏反应（K_v2.1-shRNA感染的对照组小鼠也一样）。总的来说，这些证据强调了K_v2.1通道参与外周感觉神经元中Cdyl缺陷引起的抗伤害性感受。

7. 开发强效CDYL拮抗剂

         由于CDYL在疼痛处理中不可或缺，因此寻找CDYL的化学拮抗剂可能是治疗疼痛的潜在策略。研究人员通过修饰拟肽配体（作者前期研究报道拟肽配体与CDYL染色质结构域家族具有适度的亲和力）和分析筛选，得到UNC6261，并验证UNC6261与CDYL染色质结构域的结合。总的来说，UNC6261是一个强有力的CDYL拮抗剂，可充当评估CDYL拮抗对疼痛处理影响的有用工具。

         为评估UNC6261产生镇痛作用的能力，用10、30或100 μm UNC6261孵育DRG神经元24 h，然后进行全细胞电流钳以测试内在神经元膜特征。与对照组比较，DRG神经元中30 μm和100 μm UNC6261处理RMP明显降低，诱发AP的平均数量显著减少，并增加了AP阈值和AHP幅度。此外，100 μm UNC6261也增加了DRG神经元的电流阈值。接下来，UNC6261注射到小鼠单侧L4-5 DRG以测试其对痛觉的影响。体内结果显示，UNC6261处理小鼠的基础疼痛阈值增加。令人鼓舞的是，在SNI模型中，小鼠在疼痛开始后注射0.7或2.1 mg·kg⁻¹ UNC6261可成功缓解机械性超敏反应。综上所述，利用CDYL拮抗剂进行外周治疗可能是神经病理性疼痛治疗有潜力的策略。

结论

         本研究通过多种技术手段证实，CDYL通过招募H3K27me3表观调控Kcnb1的转录，增加DRG感觉神经元的兴奋性，促进痛觉敏化。本文揭示了外周感觉神经元中表观调控因子CDYL调控痛觉感受及慢性疼痛发生发展，并和合作者合作开发了具有镇痛作用的CDYL特异性小分子抑制剂，为疼痛发病的表观遗传调控机制提供了新启示。

         北京大学神经科学研究所、北京大学IDG/麦戈文脑研究院王韵教授和北卡罗来纳大学教堂山分校的Lindsey I.James教授为本文的共同通讯作者，北京大学神经科学研究所2016级直博生孙兆炜是本文的第一作者。北卡罗来纳大学教堂山分校的Jarod M.Waybrigh博士及加拿大多伦多大学Jinrong Min教授团队对本研究具有重要贡献。本论文得到国家自然科学基金、科技部重大项目计划的资助。
 

通讯作者介绍

         王韵，北京大学神经科学研究所/基础医学院神经生物学系教授，北京大学IDG/麦戈文脑研究院PI，博士生导师，国家杰出青年基金获得者。现任北京大学基础医学院教学院长、北京大学神经科学研究所副所长。

科研方向：

王韵教授课题组主要从事神经系统细胞信号转导的研究。综合利用多学科手段，整合分子生物学、生物化学、遗传学、电生理学、形态学和行为学等方法，主要进行以下两方面的工作：

1.痛与痛觉调制的细胞信号转导通路：采用慢性病理性疼痛模型，研究痛觉传导通路中，外周和中枢神经元发生的可塑性变化，并围绕细胞信号转导的核心分子——蛋白激酶，深入探讨慢性痛，相关痛相关负性情绪及痛记忆产生的特异的信号通路，以期发现新的镇痛靶点或镇痛药物，为解决临床镇痛问题提供新思路。

2.神经发育和损伤修复机制：采用体外培养细胞和在体动物模型，探讨参与神经元极性建立、迁移、树突发育、突触形成和修剪等神经发育过程，以及外周神经损伤后修复（与发育过程享有一些共同的分子机制）和神经元缺血损伤/抗损伤过程的关键分子，旨在阐明先天性神经发育疾病，神经退行性疾病及后天性神经损伤如机械、缺血损伤等过程的病理机制，找到其中的关键分子，设计可能的干预策略，从而为一些临床常见神经精神疾病的治疗提出新方法。

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