【客户文章】《Advanced Science》中山大学曾园山团队在大动物全横断脊髓损伤的治疗策略方面取得新突破

        脊髓损伤(spinal cord injury, SCI)导致不可逆的组织缺失，包括灰质中的神经元及白质中的少突胶质细胞。SCI后的自发再生是有限的，并且没有有效的干预措施来增强内源性再生以补充缺失的组织，导致功能缺陷。使用神经移植可以重建损伤区域中的神经组织以补充损伤间隙，促进运动、感觉和自主神经功能的恢复。哺乳动物脊髓损伤修复的难处在于脊髓损伤处形成不利于神经再生的微环境，皮质脊髓束等脑下行的神经束难于再生穿越损伤区支配靶神经元。如何重建脊髓受损的神经环路是修复治疗的关键。干细胞治疗和组织工程技术的快速发展为SCI的治疗提供了希望。

        近日，中山大学曾园山教授课题组在工程技术顶.级期刊《Advanced Science》上发表题为“Tissue-Engineered Neural Network Graft Relays Excitatory Signal in the Completely Transected Canine Spinal Cord”的研究成果。研究揭示了在体外预构建的神经干细胞（neural stem cells, NSCs）源性神经网络组织含有成熟的功能性神经元和具有良好的突触形成潜能，神经网络组织移植到脊髓缺损处能够与传递大脑下行神经信息的神经纤维建立突触连接，通过移植神经元对脑源性神经信息的中继作用，修复了脊髓兴奋性神经传递环路。此项研究为SCI的治疗提供了重要依据。

        研究团队基于脊髓损伤后内源性干细胞动员不足和在脊髓损伤处复杂微环境影响下直接移植外源干细胞面临的分化不确定性和异位增殖的风险，提出应用干细胞定向诱导分化技术和组织工程培养技术在体外预构建神经网络组织作为神经元中继器修复脊髓受损神经环路的理论假说。在应用大鼠模型充分证实该理论假说的基础上，首次应用比格犬的全横断脊髓损伤模型对神经干细胞源性神经网络组织的修复效果和修复机制进行了深入研究。

        犬脊髓损伤后具有和人相似的病理反应、免疫反应和修复机制。相比非人灵长类，犬模型具有研究成本较低、易于脊髓全横断造模、易于护理、更易于进行行为学和影像学检测的优点。团队利用比格犬模型解释和回答临床转化研究中大鼠模型无法回答的重要问题：能否用过表达神经营养因子-3（neurotrophin3, NT-3）的比格犬的施万细胞（Schwann cells, SCs），来诱导过表达NT-3受体TrkC的犬的NSCs在3D胶原海绵(collagen sponge, CS)支架的培养体系中成功构建神经网络组织？神经网络组织移植到犬脊髓全横断损伤处能否看到明显的行为学的改善？神经网络组织修复犬运动功能的机制是什么？是否具有很好的应用安全性？
 

1. 体外NSCs来源的神经网络组织的表型和功能鉴定

        为了构建NSCs来源的神经网络组织，将NT-3-SCs和TrkC-NSCs在3D CS支架上共培养14天，研究表明，过表达NT-3的比格犬其SCs不但能够在体外将过表达TrkC的比格犬的NSCs诱导为功能性神经元，还能够提供营养和支持的作用，促进神经元之间形成丰富的突触连接以及促进神经元轴突的髓鞘化，从而在体外构建出具有成熟突触和髓鞘的神经干细胞源性神经网络组织（图1）。

2. NSCs来源的神经网络组织植入SCI犬后，其功能得到改善

        将体外预构建的功能性神经网络组织移植到比格犬胸段脊髓全横断损伤处，4个月后即能有效地促进瘫痪犬后肢运动功能的修复，重建后肢的承重和协调步态。电生理结果提示，脊髓运动和感觉的电传导功能得到了一定的修复（图2）。

图2. 神经网络组织植入脊髓全横断损伤比格犬后的行为、影像和电生理检测
 

3.神经网络组织植入SCI犬后，神经回路的结构和功能得到修复

        组织学检测表明移植细胞可以存活长达18个月以上，并维持神经元的表型。为了解析神经网络组织的修复机制，团队还应用了先进的免疫电镜技术和大动物顺行/逆行的跨多突触神经示踪技术。结果表明，体外预构建的神经网络组织能够与传递大脑下行神经信息的神经纤维建立突触连接，将脑源性兴奋性神经信息传递给损伤下端的运动神经元（图3）。通过移植神经元对脑源性神经信息的中继作用，修复脊髓兴奋性神经传递环路从而促进了后肢运动功能的修复。研究还观察到犬后肢良好的协调运动功能的恢复，表明除了兴奋性神经环路的修复以外，神经网络组织内一定比例的抑制性中间神经元可能发挥了运动调节作用。

总结

        在此项研究中，团队使用了枢密科技的工具病毒VSV（顺行跨多）和PRV（逆行跨多），实现了大动物的顺行和逆行跨多突触神经通路示踪，证实了体外预构建的神经网络组织能够与传递大脑下行神经信息的神经纤维建立突触连接，将脑源性兴奋性神经信息传递给损伤下端的运动神经元。

        作为临床前研究，该工作显示神经网络组织应用于脊髓损伤修复的安全性，在所有的移植神经网络组织的犬模型中没有观察到痛觉异常和自残现象，采用组织工程预构建的手段，应用临床级种子细胞和生物材料进行神经网络组织的标准化构建将有望作为临床修复脊髓神经环路的有效手段。

        该课题得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金重大项目的资助。中山大学赖碧琴研究员为此论文的第一作者，车明天博士为共同第一作者，曾园山教授和曾湘研究员为此论文的通讯作者。

        原文链接：https://onlinelibrary_wiley.gg363.site/doi/pdf/10.1002/advs.201901240

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