全基因组甲基化分析

服务简介

      DNA甲基化(DNA methylation)是基因调控的手段之一，在维持细胞正常功能、传递基因组印记、胚胎发育、肿瘤发生等方面起着至关重要的作用，更是表观遗传学研究的热点。DNA甲基化是重要的表观遗传学标记信息，哺乳动物DNA甲基化主要为CG型，而富含CpG二核苷酸的CpG岛常位于转录调控区附近，与56%的人类基因组编码基因相关。获得全基因组范围内所有C位点的甲基化水平数据，对表观遗传学的时空特异性研究具有重要意义。

      全基因组DNA甲基化测序（Whole Genome Bisulfite Sequencing，WGBS），是将重亚硫酸盐处理方法和Illumina高通量测序平台相结合，对有参考基因组的物种在全基因组水平进行高精准甲基化研究。WGBS可以达到单碱基分辨率，精确分析每一个胞嘧啶的甲基化状态，从而构建精细的全基因组DNA甲基化图谱。

技术特点

      基于全基因组重亚硫酸盐转化的WGBS法，实现单碱基分辨率的甲基化位点精准、高效定位。精准获得全基因组甲基化的C位点，是甲基化测序的金标准；全面分析不同处理对全基因组甲基化水平的影响，快速准确地找到差异甲基化区域。

服务流程

      接收样品——DNA提取——Bisulfite转化——文库构建——PE150测序——信息分析

样本要求

      1、组织样品≥50mg

      2、DNA样品

               （1）请提供总量≥3μg/样本，浓度≥100ng/μL的DNA，OD260/280介于1.8-2.0之间；

               （2）电泳检测无明显RNA污染，基因组条带清晰、完整，无降解；

               （3）样品保存期间切忌反复冻融，送样时请使用干冰运输。

服务周期

     自收到样本到交付****自然日

信息分析

      WGBS是基于全基因组水平，实现单碱基分辨率的甲基化位点精准定位，快速准确地找到差异位点，实现高效分析DMR及相关基因的功能分析。

分析项目：

     1、测序数据质量评估，过滤掉低质量数据，保证数据质量

     2、与参考基因组比对，比对率和覆盖度分析

     3、甲基化位点calling，分析甲基化位点

     4、甲基化分布，甲基化在基因组，染色体，功能元件上的分布

     5、差异甲基化分析，寻找DMR

     6、相关基因分析，相关基因GO，KEGG富集分析

     7、多样本分析，PCA分析多样本甲基化变化规律

1、原始数据质量控制

      针对过短序列，污染序列，尾端低质量序列，进行下机原始数据（Raw Data）的过滤，并采用Fastp对于过滤前后的数据进行质控，得到碱基质量，GC含量，长度分布等分析结果。

2、序列比对（DNA Mapping）

      采用Bismark等软件将过滤后的数据链特异性地比对到参考基因组上，得到5mC的甲基化类型、状态、比例，用于后续甲基化水平、分布及差异甲基化分析。采用Samtools工具，对于基因组比对文件，进行排序并建立索引。

3、甲基化水平及分析

      采用Bismark算法对5mC鉴定分析结果进行甲基化类型、水平和分布的分析，得到在不同样本中的甲基化类型、水平及其基因组上的分布情况。

4、样本相关性、聚类、PCA分析

      以每一个样本的5mC鉴定分析结果为研究对象，采用PCA降维算法，Pearson相关性系数，K-Mean聚类等多种算法，对于每一个甲基化测序样本的甲基化程度以及样本相关性进行描述，得到样本的关联结果。

5、差异甲基化区域（DMR）筛选

      以每一个样本的5mC鉴定分析结果为研究对象，采用Methykit算法，对于差异甲基化区域进行分析，得到不同样本间差异的甲基化区域。

6、DMS/DMR相关基因分析

      依据DMR注释获取DMR相关的基因群，然后针对该基因群进行相关基因群的GO、KEGG Pathway和PPI分析。

7、差异甲基化区域（DMR）注释

      采用ChipSeeker算法，对于差异甲基化区域进行注释分析，得到DMR对应的基因以及所在的基因结构，包括启动子、外显子、内含子、基因间区等。

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