研究新冠 S 蛋白与 ACE2 受体作用的重组假病毒载体和细胞模型 —助力新冠药物开发和中和抗体评估

        2019 年末暴发的新型冠状病毒（SARS-CoV-2）疫情，已导致全球累计确诊逾 500 万人，累计死亡人数逾30万，严重危及人类生命安全。在科研人员努力下，关于 SARS-CoV-2 感染和传播的机制以及抗病毒药物的研究进展迅速。随着对 SARS-CoV-2 研究的深入，人们逐渐认识其对人类社会的威胁将是长期且复杂的：1）虽然瑞德西韦、氯喹等药物被寄予厚望，但近期临床研究结果表明，上述药物在新冠患者治疗上是否有明确效果，仍存巨大争议；2）疫苗作为保护健康人群，预防新冠病毒感染的有效武器，仍然处于漫长的开发早期；3）新冠康复者是否再次复发仍存在巨大不确定性；4）新冠病毒极高的变异性，为药物疫苗开发带来不确定性。上述因素给全球疫情防控带来了巨大困难。特.效药物开发、有效疫苗开发，新冠康复者体内病毒水平及时监测评估，是从根源上战胜疫情的关键手段。

        SARS-CoV-2 的高传染性和高致病性使其研究工作必须在生物安全三级（BSL-3）实验环境下开展，这严重阻碍了新冠疫苗、药物研发的推进速度。面对疫情防控的紧迫需求，我司利用病毒学技术平台优势，结合 SARS-CoV-2 基因组和生物学特征，开发了新冠病毒S 蛋白包装的新型假病毒、表达S 蛋白和ACE2受体的重组假病毒载体、和稳定表达ACE2受体的细胞系，可模拟 SARS-CoV-2 病毒通过 S 蛋白结合ACE2受体感染细胞的生物学过程。该系统可在BSL-2级别实验室开展相关研究工作。详细介绍见第三板块产品信息。

该系统可应用于以下领域研究： 

 1. 评价治疗药物在下述抗病毒机制和药效研究中的作用

        （1）抑制病毒S蛋白与ACE2受体结合；

        （2）抑制病毒在细胞内囊泡释放；

2. 分析中和抗体水平；

        （1）评估治疗性单克隆中和抗体有效性；

        （2）分析和评估新冠疫苗研发项目在免疫动物、人体实验中的中和抗体水平以及未来上市的新冠疫苗免疫人体后中和抗体水平；

        （3）检测新冠康复者体内中和抗体水平动态变化规律，及其与新冠康复者基础性疾病、健康状况、未来是否复阳，或成为无症状病毒携带者的关联分析，为后期疫情防控关口前移提供理论和方法依据。
 

SARS-CoV-2的感染机制

1. SARS-CoV-2 受体

        人类血管紧张素转换酶2 (ACE2)，是一种膜结合糖蛋白，是SARS-CoV-2 病毒与膜结合的主要受体，它参与病毒和宿主细胞特异性结合及进入过程(见图1)。ACE2 分布于全身各组织，以肺、副睾、睾丸最高，其次为十二指肠胰、卵巢主动脉。甲状腺、脾肾与肝的含量甚微^[1]。
 

图1  SARS-CoV-2 S 蛋白与 ACE2 相互作用

        美国Jason S. McLellan 团队运用冷冻电镜技术解析了新型冠状病毒S 蛋白结构 (见图2)，证明了 SARS-CoV-2 的S 蛋白与 ACE2 的亲和力是SARS 的十倍^[2]。而中国科学院微生物研究所在线共享的新型冠状病毒表面刺突糖蛋白受体结合区（receptor-bindingdomain, RBD） 与人受体 ACE2 复合物晶体结构，再次揭示了 S 蛋白与 ACE2 受体的相互作用^[3]。
 

图2  SARS-CoV-2 S 蛋白结构图

编号:NMDCS0000001，http://nmdc.cn/nCoV
 

2. SARS-CoV-2感染宿主细胞过程

        SARS-CoV-2的S 蛋白与宿主细胞（如呼吸道黏膜细胞、肺细胞，血管内皮）膜上的受体ACE2 结合，进一步介导细胞网格蛋白介导内吞小体形成囊泡，囊泡与病毒膜融合，病毒基因组 RNA 被释放到细胞质，启动病毒基因组 RNA 复制、病毒相关编码基因的转录和翻译。病毒 RNA 和核衣壳（N）结构蛋白在细胞质中复制、转录或合成，而其他病毒结构蛋白，包括 刺突（S）、膜（M）和包膜（E），转录后在内质网（ER）中翻译并运输到高尔基体。病毒RNA-N复合物和S，M，E蛋白进一步在 ER-高尔基中间室（ERGIC）中组装，形成成熟的病毒粒子，然后从宿主细胞释放图^[4]。
 

图3  SARS病毒的生命周期（ 图片来源 Trends in Immunology）
 

3. 假病毒系统介绍

        非病毒DNA被与病毒外型相同的蛋白质外壳包裹成的微生物颗粒。假病毒（Pseudovirus）是指目的病毒能够整合另外一种不同种类病毒的囊膜糖蛋白，从而形成的具有外源性病毒的囊膜，而基因组保持着目的病毒本身基因组特性的病毒，它可携带荧光素酶/荧光蛋白等报告基因，具有高效、稳定、安全，可长期稳定制备，应用范围广等特点。目前，慢病毒、逆转录病毒、水泡性口炎病毒、腺病毒等都已被开发为假病毒在体内实验中广泛使用。如研究埃博拉病毒（EBOV）、马尔堡病毒（MARV）和拉沙热病毒（LASV）的感染机制、受体识别、病毒抑制，以及开发和评估抗体和疫苗。基于SARS-CoV-2假病毒载体（Pseudovirus VSV/LV-S）已被用于研究 SARS-CoV-2 入侵人体细胞的具体机制^[5]。

产品信息

1. 产品列表

        枢密科技开发了 SARS-CoV-2-S 蛋白包装的假病毒载体（表1）、表达SARS-CoV-2-S 蛋白的重组病毒载体（表2）、表达 ACE2 受体重组病毒载体和过表达细胞系（表3），上述三类产品可组合用于建立细胞/动物水平的 SARS-CoV-2感染模型，可研究SARS-CoV-2的感染机制、药物开发、中和抗体有效性及疫苗研发的分析评估。
 

表 1 SARS-CoV-2-S蛋白包装的假病毒载体

表 2 表达 SARS-CoV-2-S 蛋白的重组病毒载体

表 3 表达 ACE2 的病毒载体和细胞系

2. 产品使用模式图
 

图4 单次感染示意图（图片改自The spike protein of SARS-CoV — a target for vaccine and therapeutic development) 

图5 多次感染示意图（图片改自The spike protein of SARS-CoV — a target for vaccine and therapeutic development)

图6 模拟新冠细胞系感染模型

图7 模拟新冠多器官感染模型
 

3. 我司病毒产品测试结果

        通过SARS-COV-2-S蛋白包装的VSV假病毒侵染表达ACE2的细胞系，分别观察病毒侵染5h和24h后细胞系的荧光水平，可知SARS-COV-2-S包装的VSV假病毒对稳定表达ACE2的细胞系有极强的感染活性。
 

图8 VSV-S-△G-mcherry侵染细胞24h结果   A:293T, B:BHK, C:293T-ACE2 ,D:BHK-ACE2 

应用

1. 构建模拟SARS-CoV-2感染细胞/动物的研究模型；

2. 药物筛选：

        (1) 潜在抗病毒感染的候选药物筛选，包括已上市药物、临床实验药物，研发早期药物（小分子药、抗体药、蛋白酶、复方药剂、中成药等）；

        (2) 病毒在囊泡膜融合和释放机制研究，及相应途径候选药物筛选评价：

3. 血清学中和抗体效价评估：

        (1) 治疗性中和抗体效价评估；

        (2) 各类疫苗在动物实验和临床实验中产生的中和抗体效价评估；

        (3) 检测新冠康复者体内中和抗体水平动态变化规律,及其与新冠康复患者基础性疾病、健康状况、未来是否复阳，或成为无症状病毒携带者的关联分析，为后期疫情防控关口更加前移提供理论和方法依据。
 

参考文献

[1] Thomas T . SARS-CoV-2 receptor ACE2 expression in the human heart: cause of a post-pandemic wave of heart failure [J]. European Heart Journal.2020.9(1):45.

[2] Wrapp , Wang NS, Corbett KS et al.Cryo-EM structure of the 2019-nCoV spike in the prefusion conformation[J].Science.2020. 367:1260–1263.

[3] Yuan M, Wu NC, Zhu XY, et al. A Highly Conserved Cryptic Epitope in the Receptor Binding Domains of SARS-CoV-2 and SARS-CoV[J]. Science.2020.368(6491):630-633.

[4] Yao XH , He ZC , Li TY, et al.Pathological Evidence for Residual SARS-CoV-2 in Pulmonary Tissues of a Ready-For-Discharge Patient[J]. cell research.. 2020. 28:1-3.

[5] Nie J , Li Q , Wu J , et al. Establishment and validation of a pseudovirus neutralization assay for SARS-CoV-2[J]. Emerging Microbes & Infections.2020.9(1):680-686.