荧光素酶报告基因载体构建

技术简介

      萤光素酶（Luciferase）报告基因系统是以荧光素(luciferin)为底物来检测荧光素酶活性的一种报告系统。该系统中，荧光素酶催化其底物荧光素氧化，并将该反应的化学能几乎100%转变为光能，因而是一种高效的生物发光系统(bioluminescence)。由于大多数哺乳动物体内无内源性表达荧光素酶或其底物荧光素，且该反应灵敏度高、线性范围宽，反应迅速、易于定量，因而是理想的报告基因。由于单报告基因检测结果易受细胞数量、转染效率、细胞状态、裂解效率等因素的影响，现普遍采用双荧光素酶报告基因检测法。在双荧光素酶报告基因测试中，将共转染的“对照”报告基因会作为内对照，为试验提供一基准线。实验报告基因经过内参照的处理可以减小细胞活性和转染效率对实验的影响，因此双报告系统减少了外部干扰，使得实验数据更可信。萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶是常用的两种报告基因，实验中报告基因和对照基因的酶没有种源同源性，萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶对应不同的反应底物，反应中没有任何的交叉干扰。
 

技术应用

双荧光素酶实验通常用于以下研究方向:

1. 验证miRNA同靶基因的互作mRNA靶向互作。

      该应用的原理是miRNA是真核生物中具有调控功能的非编码RNA，可以通过碱基互补配对的方法结合靶基因的3‘-非翻译区（UTR），并根据互补程度不同降解靶基因或阻遏靶基因翻译。将待测靶基因的预测靶向序列插入报告基因载体中F-Luc的3’UTR区域，再共转入该miRNA mimics，如果荧光素酶活性下降，则提示待测序列为miRNA的靶序列。目前研究中常用的靶基因为mRNA、LncRNA或circRNA。

2. 启动子/增强子结构分析。

      将启动子区域序列（通常2k左右）进行分段截短，或对特定位点进行突变，再分别构建入luciferase报告载体中替换启动子序列，检测其启动子活性。

3. 验证特定转录因子同其调控序列的作用。

      将预测的与转录因子互作的启动子序列插入报告基因载体，同时在实验细胞中共转过表达该转录因子，可分析转录因子过表达是否提高荧光素酶活性。

4. 验证信号通路活化。

      将通路相关的下游应答元件构建入报告基因载体的启动子区域，若通路被活化则荧光素酶活性升高。

服务流程
 

客户提供

1.需提供详细的转录因子、目的基因或microRNA等相关信息；如有基因模板或构建好的表达载体可直接提供；

2.实验细胞：如无特殊要求，默认使用293T细胞。

最终交付

实验流程及完整报告一份，包括实验原始数据、图片、分析结果等。


案例展示
 

参考文献

1. Liang Z, et al. Stem Cell Res Ther. 2017 Nov 7;8(1):251.

2. Lorenz WW, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 May 15;88(10):4438-42.

3. Farr A, Roman A. Nucleic Acids Res. 1992 Feb 25;20(4):920.

4. Sherf, B.A. et al. 1996 Promega Notes 57, 2-9.

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