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动物模型构建/疾病模型构建
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武汉枢密脑科学技术有限公司
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公司新闻/正文
【枢密新成果】用于制备乙肝动物模型的「rAAV8-1.3xHBV」
3386 人阅读发布时间：2023-06-13 16:53
背景
乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 属于嗜肝 DNA 病毒科 (Hepadanaviridae)，具有很强的感染性，其基因组为松散的环状双链 DNA (relaxd circular DNA, RC DNA)，通过在宿主细胞核内形成共价闭环的 DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 作为转录模版，形成乙肝病毒扩增所必需的前基因组 RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次经反转录形成负链 DNA，DNA 复制形成双链 DNA，完成病毒基因组的扩增过程 [1]。慢性乙肝病毒感染可导致严重肝脏病变或衰竭，甚至造成癌症。虽然通过接种乙肝疫苗可以有效预防 HBV 的感染，但现有疗法不能完全清除病毒，全世界仍有约 2.57 亿（3.5%）人口感染 HBV，其中非洲、中东、中国和东南亚以及西太平洋地区感染率较高，共计约 2.35 亿人口，存在巨大的未被满足的需求 [2]。
现有乙肝治疗药物主要为逆转录酶抑制剂和干扰素，需长期用药，一旦停止病毒就会重新爆发。2018 年 11 月，FDA 发布的抗乙肝病毒感染药物开发指南，提出开发新型乙肝疗法的目标是「在治疗结束后较低的病毒复发和肝脏疾病进展风险」[3]，这意味着临床前药物评估需要在能模拟乙肝病毒长期感染的动物模型中进行。然而乙肝病毒宿主范围狭窄，不容易直接建立长期感染的动物模型。目前广泛采用重组腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV) 载体携带乙肝病毒体内表达的方式实现长期感染的动物模型。
rAAV8-1.3xHBV 简介
枢密科技利用 AAV 基因组能在宿主细胞中稳定存在的特性以及 8 型 AAV 嗜肝性的特点，开发了携带 1.3 拷贝 HBV 全长基因组的腺相关病毒产品 rAAV8-1.3xHBV（血清型：ayw，基因型：D）[4]，其模拟了 pgRNA 的形成，更贴近病毒天然的生活周期，能稳定的建立乙肝病毒长期感染的状态。通过小鼠尾部静脉注射制备 HBV 持续性感染的动物模型应用于 HBV 药物评价和筛查的研究。此产品线可方便、快速的为科研院校以及工业客户等提供稳定的、优良的产品服务。
效果验证
C57 小鼠静脉注射总量分别为 2.3x1010vg，5x1010vg 和 10x1010vg 按比例稀释的病毒液，体积为 200uL。 眼眶采血检测血清中乙肝病毒标记物 HBsAg、HBeAg 和 DNA 含量，连续观察 7 周。
乙肝病毒感染小鼠模型比较
目前用于研究的乙肝动物模型有 HBV 树鼩模型、土拨鼠肝炎病毒和鸭肝炎病毒，但这些动物并未建立纯系品种，难以标准化，且后两者由于和人 HBV 亲缘性较远，难以模拟人感染 HBV 的病理特征。小鼠缺乏 HBV 受体，不能用直接感染的方法建模，目前常用的小鼠乙肝病毒感染模型各有优劣，如下表所示：
枢密优势
枢密的生产系统、质控系统都严格按照标准文件执行，可确保产品的质量和批次间的稳定性。rAAV8-1.3xHBV 在生产的过程中采用的系统不含人源细胞系，避免了生产过程中产生野生型 HBV 病毒颗粒的风险，安全性高，此系统不仅可以实现大规模的生产而且具有较高的产率和稳定性。因此，枢密开发的 rAAV8-1.3xHBV 既能满足基础科研，也能满足工业客户的要求。
腺相关病毒产品采用碘克沙醇密度梯度离心纯化，通过荧光定量 PCR 检测 AAV 基因组 ITR 序列测定滴度，通过凝胶电泳结合银染检测产品纯度。
使用环境及注意事项
运输及保存方法
欢迎新老客户前来垂询。
参考文献
[1] Ganem D. Hepadnaviridae. The viruses and their replication [M] . // Fields B N, Knipe D M, Howley P M. Fields virology. 3rded. Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher, 1996: 2703-2737.
[2] GLOBAL HEPATITIS REPORT. 2017.
[3] Chronic Hepatitis B Virus Infection: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. FDA. 2018.
[4] Haifeng Wang, Seahee Kim, and Wang-Shick Ryu. DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Inhibits Hepatitis B Virus Reverse Transcription by Incorporation into Nucleocapsids. Journal of General Virology (2009). 5815-5824.
乙肝病毒 (Hepatitis B virus , HBV) 属于嗜肝 DNA 病毒科 (Hepadanaviridae)，具有很强的感染性，其基因组为松散的环状双链 DNA (relaxd circular DNA, RC DNA)，通过在宿主细胞核内形成共价闭环的 DNA (covalently closed circular DNA, cccDNA) 作为转录模版，形成乙肝病毒扩增所必需的前基因组 RNA (pregenomic RNA, pgRNA)，再依次经反转录形成负链 DNA，DNA 复制形成双链 DNA，完成病毒基因组的扩增过程 [1]。慢性乙肝病毒感染可导致严重肝脏病变或衰竭，甚至造成癌症。虽然通过接种乙肝疫苗可以有效预防 HBV 的感染，但现有疗法不能完全清除病毒，全世界仍有约 2.57 亿（3.5%）人口感染 HBV，其中非洲、中东、中国和东南亚以及西太平洋地区感染率较高，共计约 2.35 亿人口，存在巨大的未被满足的需求 [2]。
现有乙肝治疗药物主要为逆转录酶抑制剂和干扰素，需长期用药，一旦停止病毒就会重新爆发。2018 年 11 月，FDA 发布的抗乙肝病毒感染药物开发指南，提出开发新型乙肝疗法的目标是「在治疗结束后较低的病毒复发和肝脏疾病进展风险」[3]，这意味着临床前药物评估需要在能模拟乙肝病毒长期感染的动物模型中进行。然而乙肝病毒宿主范围狭窄，不容易直接建立长期感染的动物模型。目前广泛采用重组腺相关病毒 (adeno-associated virus, AAV) 载体携带乙肝病毒体内表达的方式实现长期感染的动物模型。
rAAV8-1.3xHBV 简介
枢密科技利用 AAV 基因组能在宿主细胞中稳定存在的特性以及 8 型 AAV 嗜肝性的特点，开发了携带 1.3 拷贝 HBV 全长基因组的腺相关病毒产品 rAAV8-1.3xHBV（血清型：ayw，基因型：D）[4]，其模拟了 pgRNA 的形成，更贴近病毒天然的生活周期，能稳定的建立乙肝病毒长期感染的状态。通过小鼠尾部静脉注射制备 HBV 持续性感染的动物模型应用于 HBV 药物评价和筛查的研究。此产品线可方便、快速的为科研院校以及工业客户等提供稳定的、优良的产品服务。
图 1. 用于建立乙肝病毒感染动物模型的 AAV-1.3xHBV 产品基因组结构示意图，包含完整乙肝病毒基因组的 4 个开放读码框和上游重复区域。
效果验证
C57 小鼠静脉注射总量分别为 2.3x1010vg，5x1010vg 和 10x1010vg 按比例稀释的病毒液，体积为 200uL。 眼眶采血检测血清中乙肝病毒标记物 HBsAg、HBeAg 和 DNA 含量，连续观察 7 周。
图 2. 用 AAV-1.3xHBV 建立小鼠乙肝病毒长期感染模型效果测试。A-C，不同剂量病毒尾静脉注射，检测血清乙肝病毒标记物含量，每个剂量组检测 5 只小鼠。D-F，最高剂量组 5 只小鼠乙肝病毒标记物个体检测结果
乙肝病毒感染小鼠模型比较
目前用于研究的乙肝动物模型有 HBV 树鼩模型、土拨鼠肝炎病毒和鸭肝炎病毒，但这些动物并未建立纯系品种，难以标准化，且后两者由于和人 HBV 亲缘性较远，难以模拟人感染 HBV 的病理特征。小鼠缺乏 HBV 受体，不能用直接感染的方法建模，目前常用的小鼠乙肝病毒感染模型各有优劣，如下表所示：
表 1. 小鼠乙肝病毒感染模型比较
| 建模方法 | 优点 | 缺点 | 用途 | 造模难度/稳定性 | 成本 |
转基因小鼠 | HBV 基因组能复制，长期稳定表达乙肝表面抗原 | 不被免疫系统识别，需额外注射 T 细胞造成肝损伤，不产生 cccDNA，没有病毒感染过程 | 与细胞毒性T细胞结合可研究免疫反应，不适合靶向 cccDNA 和阻断病毒感染药物的研究 | 一般 稳定 | 较高 |
HBV-DNA 高压注射小鼠模型 | HBV 基因组能复制，模拟急性感染 | 容易激活免疫应答，导致 HBV 被清除，无重复感染过程，高压易造成机械性肝损伤 | 急性 HBV 感染研究，不适合靶向 cccDNA 和阻断病毒感染药物的研究 | 一般 不稳定 | 低 |
人肝嵌合小鼠模型 | 可直接用人HBV 阳性血清注射感染建模，完全模拟病毒感染和生活周期，有 cccDNA，可重复感染，病毒长期复制表达 | 小鼠免疫缺陷，没有完整的免疫应答 | 适合适合靶向 cccDNA 和阻断病毒感染药物的研究 | 难度大 稳定 | 很高 |
rAAV-HBV 注射感染模型 | 有病毒基因组扩增和抗原表达，血清含病毒 DNA，模拟慢性感染，有免疫应答，有肝伤 | cccDNA 不明确，不能重复感染 | 适合靶向逆转录过程、凋亡蛋白抑制因子、乙肝表面抗原抑制剂等药物研究 | 较容易 稳定 | 较低 |
枢密优势
枢密的生产系统、质控系统都严格按照标准文件执行，可确保产品的质量和批次间的稳定性。rAAV8-1.3xHBV 在生产的过程中采用的系统不含人源细胞系，避免了生产过程中产生野生型 HBV 病毒颗粒的风险，安全性高，此系统不仅可以实现大规模的生产而且具有较高的产率和稳定性。因此，枢密开发的 rAAV8-1.3xHBV 既能满足基础科研，也能满足工业客户的要求。
腺相关病毒产品采用碘克沙醇密度梯度离心纯化，通过荧光定量 PCR 检测 AAV 基因组 ITR 序列测定滴度，通过凝胶电泳结合银染检测产品纯度。
图 3. rAAV8-1.3xHBV 凝胶电泳银染。AAV 的外壳由 VP1、VP2、VP3 三种蛋白按 1:1:10 比例组成，大小分别是 87 KD、73 KD、62 KD，三条带浓度越接近上述比例，病毒质量越好。
使用环境及注意事项
- 重组腺相关病毒属于复制缺陷型的假病毒载体，但 rAAV8-1.3xHBV 携带致病基因，其病毒产品和受感染的动物对人具有感染性和致病性，应在生物安全二级条件下操作使用，运输过程也需做到隔离防护。
- 操作人员需要经过专业的生物安全培训并获得生物安全培训合格证，严格按照生物安全实验规程和手册进行操作。建议操作人员接种乙型肝炎疫苗以获得乙肝免疫能力。
- 感染了 rAAV8-1.3xHBV 的小鼠排泄物等可能含有 HBV 病毒，该 HBV 病毒对包括人在内的灵长类动物有潜在感染性和致病性，对树鼩、鸭子等动物的均具有感染性，故实验动物及废弃物的处理需要严格遵循生物安全实验规程。
- 该病毒产品及其动物模型的使用单位应该有生物安全二级实验室资质。
运输及保存方法
- 病毒采用干冰运输，通常 1-2 天送达。
- 病毒可在 4℃ 短期保存 1-2 周，但滴度会有 4-5 倍的降低。长期保存需存放于-80℃。每冻融一次，病毒滴度降低 10% 左右，应避免反复冻融。
- 理论上，病毒可于-80℃ 保存 6 个月以上，但病毒储存时间超过 6 个月后，建议在使用前重新测定滴度。
- 避免细菌、蛋白酶等污染。
欢迎新老客户前来垂询。
参考文献
[1] Ganem D. Hepadnaviridae. The viruses and their replication [M] . // Fields B N, Knipe D M, Howley P M. Fields virology. 3rded. Philadelphia: Lippincott-Raven Publisher, 1996: 2703-2737.
[2] GLOBAL HEPATITIS REPORT. 2017.
[3] Chronic Hepatitis B Virus Infection: Developing Drugs for Treatment Guidance for Industry. FDA. 2018.
[4] Haifeng Wang, Seahee Kim, and Wang-Shick Ryu. DDX3 DEAD-Box RNA Helicase Inhibits Hepatitis B Virus Reverse Transcription by Incorporation into Nucleocapsids. Journal of General Virology (2009). 5815-5824.