ArcLight，实现神经元电活动的光学记录

2012年，来自耶鲁大学医学院的Jin L和Han Z等在《Neuron》发表题为“Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescentprotein Voltage probe”的研究成果。该团队将A227D突变的荧光蛋白“super-ecliptic pHluorin”融合在电压敏感蛋白“CiVS”(Ciona intestinalis voltage sensor) 的连接肽S249位点上，开发出了新一代电压敏感探针ArcLight（ArcLight-S249），A227D突变使其荧光强度提高了14倍，是原有的基于CiVS的电压探针荧光强度的3倍。随后研究团队将荧光蛋白插入CiVS连接肽S249以外S4域附近的位点后，设计出了5种新的电压敏感探针：ArcLight-Q239、ArcLight-M240、ArcLight-K241、ArcLight-A242和ArcLight-S243，这些衍生探针的荧光强度相比于ArcLight都增强了。研究表明，ArcLight及其衍生探针可以在单次实验中用宽场荧光显微镜检测培养的哺乳动物神经元的单个动作电位和阈下电活动。

图1. ArcLight的结构示意图（Kang BE, et al., Neurosci Res, 2019, modified）

图2. A227D突变的ArcLight荧光强度得到了提高（Jin L, et al., neuron, 2012）

图3. A. 衍生探针结构示意图; B. 5种衍生探针相比于ArcLight（Arclight-S249）荧光强度都有所增加（Jin L, et al., neuron, 2012, modified）

2013年，同样来自耶鲁大学的Cao G、Platisa J及Pieribone VA等在果蝇腹外侧控制昼夜节律的神经元（lateral ventral circadian clock neurons, LNVs）中特异性表达ArcLight，通过高速（500赫兹）荧光成像可靠地检测到了果蝇大脑中特定神经元的阈下电活动和动作电位，并且通过膜片钳记录下了膜电压变化。接下来，研究人员在嗅觉感觉神经元（olfactory sensory neurons, OSNs）的不同类型神经元中特异表达ArcLight，研究结果表明，ArcLight能够在活体大脑的神经回路中精确实现多种特定神经元电活动的光学记录。

图4. 黑腹果蝇昼夜节律神经元中ArcLight的表达及昼夜节律神经元电活动的膜片钳记录（黑色）和光学记录（彩色）（Cao G, et al., cell, 2013）

图5. 气味诱导不同类型OSNs的膜电活动光学记录（Cao G, et al., cell, 2013）

为了理解大脑的回路，有必要弄清楚不同神经元群体之间的功能连通性。为此，利用基因编码钙离子探针（genetically encoded calcium indicators, GECIs）如GCaMP，进行神经元活动成像因其细胞类型特异性而成为一种强有力的方法。然而，Ca2+的变化是神经元活动的间接度量。一种更直接的方法是使用基因编码荧光电压探针（genetically encoded fluorescent voltage indicators，GEVIs）。

ArcLight是电压敏感探针中的一种，属于基因编码荧光电压探针，它能随着神经元细胞膜的电压变化而发出荧光，因此研究人员就能实时通过宽场荧光显微镜和CCD相机（charge coupled device camera）观测到细胞中的电活动。神经元活动与膜电位直接相关，细胞膜的去极化达到阈值，导致神经元形成动作电位，Ca2+内流，细胞内的Ca2+浓度通常会大幅增加，GECIs能很好地检测到神经元细胞内Ca2+的变化，进而观测到神经元的活动。然而，由于阈下膜电位的变化通常不会影响细胞内Ca2+水平，ArcLight能告诉我们细胞膜电位的波动，因此，相比于钙指标，更能直观反映神经元的活动，更好地解决了阈下突触活动。

图6. ArcLight成像实验装置（Peter Y. Borden, et al., Neurophotonics, 2017, modified）

神经元回路由大量不同的神经元组成，根据解剖学、内在特性和表达的基因可以将这些神经元分为不同的类型。为了阐明这种神经元多样性之间的功能连通性，ArcLight的实时荧光成像将是理想的方法，因为可以选择转录启动子来将ArcLight表达到特定的细胞类型中。这种感应器与传统的电生理技术不同，能在同一时间分析多种神经元的活动。

技术应用：

1. 电压成像技术也属于光遗传学中的一种，主要用于记录细胞电位的变化，从而反映细胞的活动，在神经科学领域正在得到重用；

2. 可以运用于描述神经环路，正常和疾病状态下大脑的电环路；

3. 结合双光子成像技术，实时反映神经细胞的电活动。

枢密科技ArcLight产品列表：

参考文献：

1. Jin L, Han Z, Platisa J, Wooltorton JR, Cohen LB, Pieribone VA. Single action potentials and subthreshold electrical events imaged in neurons with a fluorescentprotein voltage probe. Neuron. 2012;75(5):779-85.

2. Cao G, Platisa J, Pieribone VA, Raccuglia D, Kunst M, Nitabach MN. Genetically targeted optical electrophysiology in intact neural circuits. Cell. 2013;154(4):904-13.

3. Peter Y. Borden, Alex D. Ortiz, Christian Waiblinger, Audrey J. Sederberg, Arthur E. Morrissette, Craig R. Forest, Dieter Jaeger, and Garrett B. Stanley. Genetically expressed voltage sensor ArcLight for imaging large scale cortical activity in the anesthetized and awake mouse. Neurophotonics. 2017; 4(3): 031212. 

4. Kang BE, Lee S, Baker BJ. Optical consequences of a genetically-encoded voltage indicator with a pH sensitive fluorescentprotein. Neurosci Res. 2019;146:13-21.