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CRISPR/Cas9基因编辑工具载体设计与构建
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武汉枢密脑科学技术有限公司
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抗体、试剂、细胞库 / 细胞培养、技术服务、耗材、实验室仪器 / 设备
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公司新闻/正文
【基因编辑】技术一：CRISPR/Cas9基因敲除
887 人阅读发布时间：2023-06-13 16:40
简介
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break, DSB），机体自身通过非同源重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
其中Cas9可根据不同菌属来源及大小进行分类，目前得到广泛应用的有SpCas9和SaCas9，SpCas9来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶，由1368个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NGG ，由于构建载体载量过大，因此所选择的病毒载体有限，通常构建在慢病毒载体上；SaCas9是来源于金黄色.葡萄.球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9核酸酶，由1053个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NNGRRT，比SpCas9小25%，能够进行AAV病毒的包装，适用范围更广。
CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
非同源重组修复DSB（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
应用
CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立
CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型
技术优势
服务内容
b、 脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染（Cas9和sgRNA）；
服务流程
客户提供
1、目的基因基因序列（序列/ID）以及物种来源；
2、需介导基因敲除的细胞（可选）；
3、病毒类型选择以及要求；
4、血清型选择。
服务信息及最终交付内容、产品
声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。
案例展示
HaoyiWang等人研究发现，CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干（ES）细胞中的五个基因（Tet1，2，3，Sry，Uty-8等位基因），通过NHEJ引入多个随机indel的靶向突变。将靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中，在两种基因中产生具有双等位基因突变的小鼠，效率为80％。CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物，这种方法将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。
参考文献
CRISPR/Cas（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats/Cas）系统是目前被广泛运用的基因编辑系统，其原理是由CRISPR转录产生的gRNA介导Cas核酸酶靶向目标序列，对序列进行切割。其中最常用的是靶向DNA的CRISPR/Cas9系统，此系统是由II类CRISPR/Cas系统改造而来，能够在植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物等多种细胞中，进行有效的靶向编辑，具有操作简易、效率高、以及作用靶位点多等优势。
CRISPR/Cas9系统中sgRNA(small guide RNA)识别并结合目标基因的靶向序列，引导Cas9对结合位点进行剪切，产生DNA双链断裂（double-strand break, DSB），机体自身通过非同源重组（non-homologous end joining，NHEJ）的方式修复DSB，参与修复的蛋白经常会在DNA末端插入或删除几个碱基，修复后的基因由于产生突变而导致功能丧失，从而实现机体内的基因敲除（Gene Knockout）。
其中Cas9可根据不同菌属来源及大小进行分类，目前得到广泛应用的有SpCas9和SaCas9，SpCas9来源于化脓性链球菌(S.pyogenes)的Cas9核酸酶，由1368个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NGG ，由于构建载体载量过大，因此所选择的病毒载体有限，通常构建在慢病毒载体上；SaCas9是来源于金黄色.葡萄.球菌（Staphylococcus aureus）的Cas9核酸酶，由1053个氨基酸组成，可识别的PAM序列为NNGRRT，比SpCas9小25%，能够进行AAV病毒的包装，适用范围更广。
CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
非同源重组修复DSB（Wiles M V et al. Mammalian Genome, 2015）
应用
CRISPR/Cas9基因敲除细胞系建立
CRISPR/Cas9基因敲除建立动物疾病模型
技术优势
- 操作简易：仅需Cas9核酸酶和sgRNA即可对目标基因靶位点进行切割；
- 效率高：在基因组水平上编辑目标基因，高度模拟目标模型，可精确编辑基因组；
- 作用靶位点多：可实现多个靶基因位点及多个基因的同时敲除；
- 提供多种基因编辑病毒工具：AAV、LV；
- 提供 BSL-1 和 BSL-2 病毒注射及实验操作平台；
- 全面的实验技术支持。
服务内容
- sgRNA的设计；
- 细胞内sgRNA剪切活性筛选；
- 敲除载体的构建；
- 依据所要编辑的细胞选择Cas9和sgRNA不同导入方式：
b、 脂质体难转染细胞：使用质粒系统电转化、慢病毒或腺相关病毒感染（Cas9和sgRNA）；
- 筛选基因敲除单克隆细胞系。
服务流程
客户提供
1、目的基因基因序列（序列/ID）以及物种来源；
2、需介导基因敲除的细胞（可选）；
3、病毒类型选择以及要求；
4、血清型选择。
服务信息及最终交付内容、产品
| 流程分布 | 周期 （工作日） | 交付内容 | 交付产品 |
| sgRNA序列的设计 | 2~4周 | sgRNA设计分析报告 | － |
| sgRNA的活性筛选 | 获得有活性的sgRNA及筛选报告 | ||
| 基因敲除质粒的构建 | 1周 | 基因敲除质粒报告 | |
| 病毒包装 | 3周 | 病毒包装报告 | 高纯度病毒 |
| 单克隆细胞分选报告 | 8周 | 单克隆细胞分选及检测结果报告 | 基因敲除单克隆细胞系 |
声明：枢密科技提供的所有基因编辑服务及该服务的后续研究，仅适用在国家法律和伦理规范的范围内实施。禁止用于任何人体或临床实验的研究；禁止用于对人类生殖体系进行基因修饰的研究；禁止将基因修饰的其他动物胚胎及生殖细胞植入人体。客户如违反相关法律规定，本公司不承担任何法律责任。
案例展示
HaoyiWang等人研究发现，CRISPR / Cas介导的基因编辑允许高效地同时破坏小鼠胚胎干（ES）细胞中的五个基因（Tet1，2，3，Sry，Uty-8等位基因），通过NHEJ引入多个随机indel的靶向突变。将靶向Tet1和Tet2的Cas9 mRNA和sgRNA共注射到受精卵中，在两种基因中产生具有双等位基因突变的小鼠，效率为80％。CRISPR / Cas系统允许一步产生携带多个基因突变的动物，这种方法将大大加速功能冗余基因和上位基因相互作用的体内研究。
小鼠胚胎干细胞的多基因敲除（Wang H et al. Cell, 2013）
小鼠和小鼠胚胎干细胞的多基因编辑（Wang H et al. Cell, 2013）
参考文献
- Wiles M V , Qin W , Cheng A W , et al. CRISPR–Cas9-mediated genome editing and guide RNA design[J]. Mammalian Genome, 2015, 26(9-10).
- Wang H , Yang H , Shivalila C , et al. One-Step Generation of Mice Carrying Mutations in Multiple Genes by CRISPR/Cas-Mediated Genome Engineering[J]. Cell, 2013, 153(4):910-918.