IF=14.1【AAV9-cTN、T介导心肌特异性过表达】Adv Sci｜深圳大学王子梅/敖英教授团队发现心肌纤维化干预新靶点CK2α

心肌纤维化以细胞外基质（ECM）过度沉积为特征，是心力衰竭、多种心肌病及衰老心脏的标志性病理改变。这种结构重构导致心室僵硬度增加和电机械功能障碍，最终推动疾病向显性心力衰竭进展。尽管神经激素调节疗法不断进步，现有治疗策略仍难以逆转已形成的纤维化病灶。其主要瓶颈在于我们对触发纤维化反应的分子始动因素认识不足。虽然心脏成纤维细胞是ECM沉积的直接执行者，越来越多研究证据表明：心肌细胞并非仅是损伤的被动承受者，还会主动参与促成纤维化微环境的形成。受应激的心肌细胞通过旁分泌信号和释放“危险信号”，调控静息成纤维细胞的活化。然而，调控心肌细胞与成纤维细胞相互作用的上游分子检查点仍不明确。

维持线粒体完整性对于心肌细胞的代偿能力至关重要。心脏对ATP的持续高需求使其对代谢应激尤为敏感。在病理性应激状态下，心肌细胞会出现代谢僵化：能量代谢由脂肪酸氧化（FAO）向糖酵解病理性切换，进而加剧能量供给不足。线粒体功能受损可通过扰乱支链氨基酸（BCAA）和三羧酸（TCA）循环代谢物稳态，进而诱发心肌纤维化。重要的是，线粒体功能紊乱带来的影响并不仅限于能量代谢层面。线粒体结构遭到破坏后，会向细胞质中释放活性氧（ROS）与线粒体DNA（mtDNA），进而激活氧化应激及无菌性炎症通路（如cGAS-STING通路、NF-κB通路），强烈刺激邻近的成纤维细胞活化。此外，线粒体结构动力学与细胞骨架紧密耦联，尤其是III型中间丝蛋白家族中的结蛋白Desmin（Des基因编码）。该蛋白可将线粒体锚定在肌节结构上。Desmin发生聚集或错误折叠时，会瓦解线粒体网状结构，诱发能量衰竭、氧化应激与蛋白毒性应激；上述病理改变正是心肌病与心肌纤维化的核心特征，这一点已在各类结蛋白病相关研究中得到证实。但机体抵御纤维化应激、维系线粒体-细胞骨架质量控制的信号调控网络，目前仍尚不明确。

酪蛋白激酶2（CK2）是一类高度保守、组成性活化的丝氨酸/苏氨酸激酶，参与细胞存活、蛋白质稳态维持等多种细胞过程。尽管CK2信号已涉及心脏发育，但其在成年心肌纤维化发病中的具体作用仍不清楚。有趣的是，在心脏成纤维细胞中，CK2活化已被证实驱动肌成纤维细胞转化和ECM合成，这与CK2在其他器官中的促纤维化作用一致。相比之下，心肌细胞属于终末分化细胞且富含线粒体，其存活依赖一套独特的信号通路。近期多项研究阐明，CK2可调控心肌细胞线粒体稳态：生理状态下，CK2通过多重机制保障线粒体完整性，包括清除ROS以发挥抗氧化作用、促进Opa1蛋白介导的线粒体融合，以及稳定Bcl-xL蛋白、磷酸化ARC蛋白从而抑制细胞凋亡。一旦CK2功能失衡（无论激酶催化活性下降还是异常过度激活），均会加剧线粒体功能障碍，成为心脏疾病进展的关键驱动因素。据此作者提出研究假说：CK2可通过维持线粒体稳态发挥心脏保护效应，而非产生损伤作用。尽管CK2的生物学效应存在上述双向复杂性，但CK2信号、线粒体蛋白质稳态与心肌纤维化重塑抑制三者之间的交互调控机制，至今仍未被阐明。

近期，深圳大学医学部基础医学院王子梅/敖英教授团队在Advanced Science（IF=14.1）发表以CK2α Deficiency Drives Myocardial Fibrosis via Desmin-Induced Mitochondrial Dysfunction为题的研究论文。该研究证实：心肌细胞内CK2α表达下调，是诱发心脏纤维化重构保守且早期的始动因素。心肌细胞特异性敲除CK2α会逐步引发线粒体蛋白质组全面紊乱、细胞代谢重编程以及能量代谢衰竭；线粒体功能受损继而诱发氧化应激与无菌性炎症，并通过IL-6/IL-6ST、TGF-β1/TGFBR2两条旁分泌轴激活心脏成纤维细胞，由此阐明了心肌细胞内在缺陷与成纤维细胞活化之间直接的分子机制关联。机制层面：CK2α可通过对Desmin第452位苏氨酸（Thr452）进行直接磷酸化修饰，维持线粒体-细胞骨架结构完整性；该磷酸化修饰会招募分子伴侣αB-晶状体蛋白（Cryab），从而阻止Desmin发生病理性聚集。一旦该质控检查点被破坏，便可完整复刻全部线粒体功能障碍及促纤维化信号通路表型。值得关注的是：借助9型腺相关病毒（AAV9）靶向回补心肌细胞内CK2α的表达，可维持线粒体结构完整、恢复心肌能量代谢功能，并显著减轻心肌纤维化。综上，本研究揭示了CK2α-Desmin-线粒体质量调控轴是心肌细胞内关键的代谢-结构检查点；证实由心肌细胞启动的旁分泌信号通路介导成纤维细胞活化，为纤维化型心脏疾病提供了全新的治疗靶点与干预策略。

1.心肌细胞CK2α下调是心肌纤维化保守分子特征

为筛选介导心肌纤维化的关键调控分子，本研究对多套公开转录组数据集开展荟萃生物信息学分析。纳入数据集涵盖人纤维化心肌样本：肥厚型心肌病（HCM，GSE180313）、扩张型心肌病（DCM，GSE1145）、缺血性心肌病（ICM，GSE5406）；多种经典动物纤维化模型：主动脉缩窄（TAC，GSE287292）、心肌梗死（MI，GSE114695）、自发性高血压大鼠（SHR，GSE19210）、异丙肾上，腺素（ISO，GSE239653）。多组数据结果一致表明，心肌细胞CK2α表达下调是进化高度保守的分子改变。对GEO公共转录组数据集拓展时序分析可见，小鼠MI术后第1天左心室CK2α mRNA水平即显著下降，且下调状态可持续至术后第一周（GSE304427），该时间窗口与心肌细胞损伤、凋亡阶段重合，提示CK2α表达下降是启动一系列病理级联反应、最终诱发慢性纤维化重构的早期始动信号；数据集GSE260489的分析也显示，ISO处理H9c2大鼠心肌成肌细胞后CK2α mRNA表达明显降低。

为验证上述生物信息学推论，本研究构建体内、体外损伤模型开展实验验证。MI术后4周小鼠慢性重构心脏样本经Masson染色可见梗死区及梗死边缘区存在大量胶原沉积；免疫组化、免疫荧光染色进一步证实CK2α仅在梗死边缘区α-Actinin阳性心肌细胞中特异性降低；蛋白免疫印迹及qPCR检测证实，CK2α蛋白、mRNA表达下降，且与纤维化标志物α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、Ⅰ型胶原（Col1a1）、Ⅲ型胶原（Col3a1）的上调同步发生。此外，研究人员构建ISO诱导小鼠心肌纤维化体内模型（持续ISO皮下注射造模），组织学检测可见典型心内膜下纤维化病变，且CK2α阳性心肌细胞数量显著减少；蛋白与mRNA水平检测也证实CK2α与纤维化标志物表达呈负相关。同样地，研究者开展体外细胞实验，对H9c2细胞给予ISO刺激处理，复现了CK2α表达抑制、纤维化蛋白蓄积的病理表型。ISO处理原代心肌细胞（CMs）后CK2α表达亦显著下调。综上，各类应激损伤下，心肌细胞会发生特异性、显著的CK2α表达下调。

图1.心肌细胞CK2α表达下调与心肌纤维化具有相关性

2.心肌细胞CK2α下调通过旁分泌通路诱发心脏纤维化

研究人员分析公共转录组数据集E-MTAB-8067（CK2α敲低模型）可见，H9c2细胞出现典型促纤维化转录特征：ECM组分Col1a1、Col4a1、Fn1与促纤维化因子Tgfb1、Vegfa、Pdgfa均显著上调。

为明确CK2α表达下调与纤维化激活的因果关联，本研究在H9c2细胞中利用siRNA沉默CK2α，结果显示，无需ISO刺激即可直接升高各类纤维化标志物表达。此外，对新生小鼠原代CMs行CK2α敲低后，仅纤维化相关基因mRNA表达明显上升，CMs自身纤维化蛋白无明显改变。随后本研究验证心肌细胞CK2α缺陷的旁分泌效应：收集CK2α沉默后原代CMs的培养上清（条件培养基CM）处理原代心脏成纤维细胞（CFs），结果显示该上清可显著促进CFs的增殖、迁移与活化。

为筛选介导该效应的关键分泌介质，本研究先检测CK2α沉默后CMs内促纤维化因子表达，再匹配CFs经CM刺激后上调的对应受体；结合下游通路磷酸化检测、CM细胞因子ELISA定量、靶向中和抗体阻断多重实验证实：心肌细胞中CK2α的表达降低主要通过激活IL-6/IL-6ST、TGF-β1/TGFBR2两条旁分泌轴，诱导CFs启动纤维化重塑程序。综上，心肌细胞CK2α下调会启动异常应激应答，通过旁分泌作用构建促纤维化微环境，最终推动心肌纤维化发生。

3.心肌细胞特异性CK2α缺失使老龄心脏易发生纤维化

为探究CK2α在心肌纤维化中的病理功能，本研究将CK2α^flox/flox小鼠与Myh6-Cre心肌特异性Cre工具鼠交配繁育，获得同时携带两种基因型的后代小鼠，于小鼠4 周龄（1月龄）时连续5天腹腔注射他莫昔芬，从而构建心肌细胞特异性诱导敲除小鼠（CK2α^cKO）。3月龄心脏蛋白免疫印迹结果证实心肌CK2α表达显著下调，且该基因型小鼠与对照组生存期无明显差异。

Masson染色证实纤维化呈年龄依赖性进展：3月龄敲除鼠胶原沉积与对照组无明显差异，12月龄胶原蓄积增多，至20月龄纤维化病变大幅加重，老龄心肌纤维化标志物、Ⅰ型胶原阳性细胞同步上调。分离12月龄小鼠原代CMs与CFs：敲除鼠仅CMs缺失CK2α，CFs自身CK2α表达无变化，但CFs纤维化标志物显著升高，证明纤维化由CMs旁分泌非自主效应介导。心脏超声结果显示20月龄敲除鼠射血分数（EF）、短轴缩短率（FS）下降，左心室前壁（LVAW）变薄，心脏收缩功能受损。TMT定量蛋白质组与通路富集分析进一步验证，CK2α缺失激活TGF-β、TNF等多条促纤维化通路，胞外基质组装通路显著上调。综上，心肌细胞CK2α缺陷会随年龄累积病理损伤，使老龄心脏易发生纤维化与收缩功能障碍。

图2.心肌细胞特异性敲除CK2α可诱导年龄相关心肌纤维化及心功能受损

4.CK2α缺失通过代谢重编程诱发心肌能量衰竭

为解析CK2α调控心肌病变的分子机制，本研究基于定量蛋白组学数据进行亚细胞分布分析。结果显示，CK2α^cKO小鼠心肌线粒体蛋白大量丢失，共107种线粒体蛋白显著下调，占全部差异下调蛋白的35.55%，是变化最突出的蛋白亚群。GO富集分析佐证线粒体内膜、基质及呼吸链复合体相关蛋白广泛抑制，氧化还原酶功能受损；KEGG通路同步显示氧化磷酸化（OXPHOS）、TCA循环、脂肪酸降解、支链氨基酸（缬氨酸/亮氨酸/异亮氨酸，BCAA）降解四大核心产能通路整体下调，GSEA分析进一步验证四条代谢通路均显著下调。

上述蛋白质组学改变提示线粒体整体代谢模式发生重塑。为此，代谢酶蛋白热图与转录定量结果进一步证实了该病理性代谢重塑的典型规律：糖酵解关键限速酶（己糖激酶1 Hk1、乳酸脱氢酶A Ldha、磷酸果糖激酶Pfkp）表达升高，FAO、BCAA分解、TCA循环相关基因持续下调。功能层面，该转变直接阻滞脂质分解，油红O染色可见CK2α^cKO心肌大量脂质堆积。靶向代谢组检测证实心肌能量代谢由OXPHOS向糖酵解转变，表现为敲除鼠心肌中乳酸、BCAA蓄积，TCA循环出现琥珀酸堆积、α-酮戊二酸耗竭的代谢阻滞；上述代谢物累积已被证实与心肌纤维化高度相关。

电子传递链（ETC）解体是能量衰竭的核心诱因。蛋白组与转录数据显示线粒体复合体Ⅰ~Ⅴ各亚基编码基因普遍下调；蛋白免疫印迹实验再次佐证：复合体标志性亚基NDUFB8、SDHB、UQCRC1、MTCO2、ATP5A1蛋白含量同步降低。呼吸链破坏直接诱发严重能量匮乏：CK2α^cKO心肌ATP含量下降32.7%，NAD⁺储备显著耗竭。体外实验中，H9c2细胞敲低CK2α后，线粒体呼吸复合体蛋白表达、ATP产量同步降低。此外，细胞外耗氧率（OCR）检测显示，抑制CK2α导致基础OCR下降25.1%，解偶联剂FCCP刺激后最大呼吸能力受损34.2%。与此一致，代谢笼分析与跑步机实验进一步证实，CK2α^cKO小鼠存在全身能耗降低、运动能力受损的表型。综上，CK2α是维持线粒体蛋白组完整性及产能稳态的核心分子。其缺失将破坏蛋白组架构，驱动病理性代谢重编程，诱发全身性能量耗竭，最终构成心肌纤维化进展的关键驱动机制。

5.CK2α维持线粒体氧化还原稳态，阻断氧化应激与炎症反应

前文已证实CK2α缺失引发线粒体蛋白降解与能量代谢衰竭，本研究进一步观测线粒体超微结构以明确后续病理损伤。透射电镜（TEM）结果显示，CK2α^cKO小鼠心肌线粒体出现明显病理性改变：整体肿胀、单个线粒体截面积增大，同时线粒体内嵴破损、嵴密度显著下降，这类结构紊乱会直接打破细胞氧化还原平衡。GSEA富集结果显示CK2α敲除心肌内ROS应答、炎症相关通路显著激活；二氢乙锭（DHE）荧光染色直观证实敲除组心肌组织ROS大量累积。生化检测同步验证氧化应激水平显著上调：脂质过氧化标志物丙二醛（MDA）含量上升，组织总超氧化物歧化酶（SOD）活性降低。

机制层面，CK2α缺失直接损伤线粒体抗氧化系统。蛋白组数据与蛋白免疫印迹结果显示，线粒体核心抗氧化蛋白—沉默信息调节因子3（SIRT3）、锰超氧化物歧化酶（SOD2）表达显著下调，进而激活p38 MAPK应激通路，磷酸化p38蛋白水平明显升高。线粒体结构破损还会释放mtDNA至胞质，启动无菌性炎症应答：NF-κB p65发生核转位，促炎因子IL-6、TNF-α转录上调；心肌组织ELISA检测也证实IL-6蛋白含量显著升高。体外H9c2细胞敲低CK2α可重现全套损伤表型：线粒体膜电位降低、ROS大量生成，并依赖NF-κB通路诱发炎症应答。为确立线粒体ROS与纤维化的因果关系，研究人员采用线粒体特异性抗氧化剂Mito-Tempo干预H9c2细胞：清除线粒体ROS后，CK2α敲低诱导的氧化应激、p38通路活化及胶原、α-SMA等纤维化标志物上调均被显著逆转。反向过表达实验验证CK2α的保护功能：转染HA-CK2α可显著抑制ISO刺激带来的ROS蓄积与氧化应激损伤，同时阻断纤维化蛋白表达上调。综上，CK2α缺失破坏线粒体完整结构，通过线粒体ROS介导的氧化应激、胞质mtDNA触发的无菌炎症形成级联反应，最终诱导心肌纤维化发生。

6.CK2α通过磷酸化Desmin Thr452位点调控线粒体蛋白稳态，抑制心肌纤维化

为打通CK2α缺失与线粒体损伤间的分子通路，本研究选取对照组与CK2α^cKO小鼠心脏开展磷酸化蛋白质组检测。主成分分析（PCA）分析显示两组磷酸化修饰谱完全分离；亚细胞注释筛选出19个线粒体蛋白磷酸化水平显著下调。将上述候选蛋白与GeneCards纤维化数据集交集比对，锁定中间丝蛋白Desmin（编码基因Des）、分子伴侣Cryab为关键候选分子。既往研究提示CK2α可调控Cryab磷酸化，但纯化重组蛋白GST-pull-down实验证实CK2α与Cryab不存在直接相互作用；而多重互作实验明确CK2α与Desmin稳定结合：心肌细胞中的部分亚细胞共定位提示二者胞内共分布，内源、外源双向免疫共沉淀（Co-IP）验证细胞内复合物存在，体外重组His-CK2α与GST-Desmin pull-down进一步证明二者直接互作。

接下来，研究人员采用无细胞体外激酶实验（ATP-γ-S/PNBM体系）证实CK2α可直接磷酸化Desmin。心肌磷酸化蛋白质组数据显示，Desmin残基Ser25、Thr452位点磷酸化修饰在CK2α敲除后大幅下降。为确定功能关键位点，构建S25A、T452A丙氨酸突变体；共转HA-CK2α后两种突变体总磷酸化均低于野生型（WT）Desmin，但纯化蛋白体外激酶实验显示仅T452A-Desmin完全消除CK2α介导的磷酸化修饰，证明Thr452是CK2α靶向Desmin的主要磷酸化位点。

已有报道Cryab可结合Desmin N端442-453残基片段，阻止其错误聚集。本研究推测CK2α介导的Thr452磷酸化是维持该分子伴侣复合物的必要条件。HEK293T细胞敲低CK2α后，损害了Cryab-Desmin复合物的形成；单独转染T452A突变体也会降低二者互作亲和力。该复合物解离直接引发Desmin病理性聚集：CK2α^cKO心肌切片可见Desmin异常聚集体，蛋白分层检测不溶性Desmin含量显著升高；H9c2细胞过表达T452A-Desmin可重现Desmin聚集、线粒体膜电位丢失表型。

为确立Desmin T452去磷酸化与纤维化的因果关系，利用CRISPR/Cas9技术构建内源Desmin^T452A定点敲入H9c2细胞系，体外激酶实验验证该细胞完全丢失CK2α催化的Desmin磷酸化修饰。T452A突变H9c2细胞自发出现Desmin聚集、线粒体去极化，不溶性Desmin累积表型；TEM观测到线粒体膜破损、嵴大量丢失；蛋白免疫印迹实验证实ETC复合体蛋白表达下调；ATP合成受阻。线粒体损伤进一步造成ROS蓄积、氧化应激标志物升高，最终诱导胶原、α-SMA等纤维化标志物上调，形成促纤维化微环境。综上，CK2α通过直接磷酸化修饰Desmin Thr452位点，稳定Desmin-Cryab分子伴侣复合体，维持线粒体结构与蛋白稳态，阻断心肌纤维化进程。

图3.CK2α通过在Thr452位点磷酸化Desmin维持蛋白质量控制，进而阻止线粒体结构解体与心肌纤维化

7.回补CK2α可减轻应激介导线粒体损伤，发挥心肌保护作用

为验证上调CK2α是否具备心衰干预潜力，本研究采用AAV9载体，借助心肌特异性cTN、T启动子实现心肌定向CK2α过表达；8周龄小鼠分别尾静脉注射AAV9-cTN、T-CK2α或空载对照病毒，4周后连续21天皮下注射ISO构建心肌纤维化模型。心脏超声结果显示，CK2α过表达可部分逆转肾上，腺素过度刺激带来的心功能损伤：ISO处理的对照组EF、FS大幅下降，而AAV9-cTN、T-CK2α组心功能指标维持稳定。心功能改善同步伴随损伤标志物水平显著回落，血清脑钠肽（BNP）、肌酸激酶同工酶（CK-MB）、IL-6水平降低，心肌肥厚标志基因心房钠尿肽（ANP）、BNP、肌球蛋白重链7（MYH7）转录表达也明显受抑。组织学层面，CK2α过表达可有效抑制心肌病理性肥厚与间质纤维化重构。相较于空载+ISO模型组，CK2α回补小鼠心重/体重比值（HW/BW）降低，心肌间质纤维化面积显著缩小。

机制上，CK2α的保护效应依赖线粒体结构与功能维持。TEM结果证实，过表达CK2α能抑制ISO刺激造成的线粒体内嵴大量丢失，稳定线粒体形态；心肌组织ATP定量检测显示，CK2α回补组ATP储备显著回升；同时重塑氧化还原平衡，MDA含量下降，心肌总SOD抗氧化活性恢复。蛋白免疫印迹结果进一步佐证上述结论：CK2α回补可挽回ETC各复合体蛋白表达水平，抑制多条促纤维化信号通路激活；更关键的是，补充CK2α能够显著抑制ISO诱导的Desmin异常聚集。上述结果完成概念性验证：提升心肌CK2α表达可修复线粒体氧化应激损伤、阻滞纤维化进展，是治疗心力衰竭可行的靶点。

图4.AAV9介导的CK2α过表达可减轻ISO诱导的心肌纤维化，并改善线粒体功能障碍