IF=19.4【客户文章】Nature子刊｜华山医院团队：脑内皮小细胞外囊泡（c-BEEVs）—脑血管损伤与认知衰退的潜力标志物

1.c-BEEVs：具备应用潜力的脑血管病变生物标志物

本研究以国内四家医院记忆门诊的346名受试者为对象，所有受试者均因临床诊断需要接受腰椎穿刺并采集脑脊液。按入组时间分为发现队列（主观认知下降（SCD）=10例、AD=15例、VCI=15例、MD=15例）与验证队列（相应各为36、87、87、81例），两队列除年龄、性别外其余基线无显著差异。为区分不同病理类型，研究人员整合了AD的A/T标志物（Aβ淀粉样蛋白病理、tau蛋白病理）与脑血管损伤标志物V（皮质下缺血性病变），将患者分为四组：SCD（A-T-V-）、AD（A+T±V-）、VCI（A-T-V+）以及MD（A+T±V+）。验证队列中的87人接受了中位12个月的随访。与未完成随访者相比，完成者的扩大的血管周围间隙（ePVS）评分、p-tau181及神经丝轻链蛋白（NfL）水平均更高。

研究人员采用透射电镜（TEM）、免疫印迹（WB）及纳米颗粒跟踪分析（NTA）技术对脑脊液来源的EVs进行形态与分子鉴定，检测所有样本的脑脊液总小EVs（40-160 nm）水平。计算CD31⁺小EVs占脑脊液总小EVs的比例，即c-BEEVs（%）。结果显示：与SCD组相比，AD、VCI和MD三组患者脑脊液总小EVs水平均升高；c-BEEVs在发现队列与验证队列中均能有效区分VCI患者与其余三组，校正年龄、性别、研究中心和VRF后组间差异仍显著（F9,336=34.92，P＜0.001）。

接下来，研究者同时联合CD31与脑内皮特异性标志物葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）双阳性验证EVs的脑源性。纳米流式结果显示，脑脊液中CD31阳性EVs约52.7%共表达GLUT1，证实其主要来源于脑内皮细胞而非全身血管。进一步通过NTA与纳米流式交叉验证发现，c-BEEVs水平与CD31⁺GLUT1⁺双阳性颗粒数量高度相关。此外，血清EVs对照实验显示，颈动脉狭窄与CSVD患者血清CD31⁺EVs均较健康志愿者升高，但两组间无差异，提示外周血管损伤也会增加血清CD31⁺EVs，而只有脑脊液中的CD31⁺GLUT1⁺双阳性EVs才真正反映脑内皮特异性损伤。

最后分析c-BEEVs与VRF及CSVD相关MRI影像改变的关联。c-BEEVs与HTN（β=0.174，P = 0.002）、2型糖尿病（β=0.125，P = 0.021）、饮酒（β=0.124，P = 0.033）及VRF总负荷（β=0.243，P＜0.001）均呈正相关，且与脑白质病变（WML，β=0.380，P＜0.001）、脑微出血数量（CMB计数，β=0.392，P＜0.001）、腔隙灶数量（Lacune计数，β=0.178，P = 0.001）呈正相关，这些关联独立于Aβ和tau蛋白病理。综上，VCI患者脑脊液中c-BEEVs表达上调，可介导VRF诱发的损伤反应并客观反映脑微血管损伤严重程度，具备作为脑血管病变临床应用生物标志物的潜力。

图1.发现队列与验证队列中EVs生物标志物的检测结果

表1.c-BEEVs与血管损伤之间的关联

2.c-BEEVs可作为VCI与AD的诊断及鉴别诊断生物标志物

考虑到血管病理与神经退行性变在认知障碍中的协同作用，研究人员进一步评估了c-BEEVs及ATN标志物（包括Aβ比值、p-tau181、t-tau以及NfL）在不同亚型中的诊断效能。结果显示：c-BEEVs能有效区分VCI与SCD，在发现队列和验证队列中的曲线下面积（AUC）分别达1.000和0.952，总体数据集AUC为0.965。NfL对VCI同样表现出较强的诊断能力，但在单一标志物中c-BEEVs的AUC最高。在VCI与AD的鉴别诊断中，c-BEEVs的AUC在发现队列和验证队列分别为0.880和0.762；在VCI与MD的鉴别中，三个数据集的AUC分别为0.764、0.711和0.720。

为进一步提升鉴别效能，研究者测试了脑脊液联合标志物的表现。结果发现，VCI组呈现较低的p-tau181水平但较高的c-BEEVs水平，而AD组则相反。c-BEEVs联合p-tau181后鉴别效能显著提高：在发现队列、验证队列和总体数据集中，区分VCI与AD的AUC分别达到1.000、0.965和0.972；在区分VCI与MD时同样表现出良好的鉴别能力。这些结果提示，c-BEEVs是诊断VCI的有前景的生物标志物，联合p-tau181可进一步改善VCI与神经退行性痴呆的鉴别。

研究者还依据临床痴呆评定量表（CDR）评分进行分层敏感性分析（CDR 0=无痴呆，0.5=可疑，1=轻度，2=中度，3=重度）。结果显示，在所有CDR阶段，VCI组的c-BEEVs水平均持续高于AD组。在早期阶段（CDR 0.5-1），VCI与MD之间的差异不显著，可能与共存的血管损伤和轻度认知损害有关；在晚期阶段（CDR 2-3），VCI组的c-BEEVs水平显著更高。在不同CDR分层中，c-BEEVs区分VCI与AD的AUC为0.775-0.907，且随着CDR评分升高，VCI与MD的鉴别效能亦改善。上述结果证实，c-BEEVs对VCI的鉴别价值在不同痴呆严重度下均稳健。

为与既往报道的脑脊液血管相关标志物进行比较，研究者在部分样本（n=90）中开展了头对头探索性分析，检测了脂质运载蛋白2（LCN2）和可溶性血小板源性生长因子受体β（sPDGFRβ）。与既往研究一致，VCI组CSF LCN2水平升高；而所有认知障碍组的sPDGFRβ水平均较SCD组升高，其中MD组最高。c-BEEVs、LCN2和sPDGFRβ对识别VCI相关表型均有诊断价值，其中c-BEEVs在区分VCI与AD及SCD时AUC更高（样本量有限，结果需谨慎解读）。此外，在另一亚组（n=89）中，c-BEEVs水平与血浆ICAM-1（内皮活化及炎症标志物）及基质金属蛋白酶-9（血脑屏障（BBB）完整性与细胞外基质重塑相关）无显著相关性，可能与血浆标志物难以完全反映脑内皮局部过程有关。

图2.c-BEEVs对VCI和AD的诊断及鉴别诊断效能

3.c-BEEVs：混合病理连续谱中的早期生物标志物

考虑到老年痴呆患者中多种病理常同时存在，研究者利用“亚型与分期推断”（SuStaIn）算法，以SCD组为对照，建立了脑脊液分期模型，用以探索混合病理中生物标志物的动态变化。结果显示：在脑脊液分期0至1期，患者最可能表现为A-T-V-（无淀粉样蛋白、tau及血管病理）；在2期，最可能表现为A+T-V+（存在淀粉样蛋白和血管病理，无tau病理）；在3至5期，则主要表现为A+T+V+（三种病理共存）。随着分期进展，患者的整体认知功能呈逐步下降趋势（基线认知评估样本量N=142），且在随访期间进一步恶化[简易精神状态检查（MMSE）Z值变化：Spearman秩相关系数ρ=-0.430，P=0.004；蒙特利尔认知评估（MoCA）Z值变化：ρ=-0.498，P=0.001；随访样本量N=45]，表明该模型可用于MD的分期。

通过局部加权回归散点平滑法（LOESS）分析各生物标志物在疾病连续谱中的变化轨迹发现：c-BEEVs在脑脊液生物标志物中最早出现异常，且在早期阶段水平升高较为突出，随后呈现平稳而适度的增长；而p-tau181的变化则主要在晚期阶段更为明显。上述结果提示，在混合病理的早期连续谱中，c-BEEVs可作为血管病理变化的早期指标，而p-tau181则在晚期阶段发挥关键作用。

图3.基于脑脊液生物标志物的混合病理分期模型

4.c-BEEVs联合p-tau181预测认知功能下降

脑部血管病理是导致认知功能下降最常见的非AD因素之一。初步分析显示，在校正淀粉样蛋白和tau病理后，c-BEEVs水平与所有受试者的基线MoCA Z值（β=-0.336，P＜0.001）及MMSE Z值（β=-0.262，P＜0.001）均呈负相关，提示c-BEEVs可作为认知功能下降中血管功能障碍的潜在生物标志物。

基于c-BEEVs的变化规律，研究者通过受试者工作特征曲线（ROC）分析，对照影像学标准确定了c-BEEVs的临界值（高于临界值为阳性，低于为阴性），并结合p-tau181的阴阳性对参与者进行重新分类，采用Kaplan-Meier生存曲线评估认知功能下降的概率。结果显示：在p-tau181阴性组中，c-BEEVs升高者的认知功能下降速度显著快于低于临界值者（P=0.018）；而在p-tau181阳性组中，高、低c-BEEVs两组之间的认知恶化速度无显著差异（P=0.78）。上述发现表明：在无tau病理时，c-BEEVs升高可预测认知功能下降；而在tau阳性阶段，神经退行性变对认知下降的影响可能超过血管变化。将神经退行性生物标志物与c-BEEVs联合使用，可为认知功能恶化提供预测工具，尤其适用于多种病理共存的情况。

图4.c-BEEVs联合p-tau181预测认知功能下降的生存曲线

5.BEEVs介导HTN诱导的认知障碍及突触功能障碍

鉴于VCI患者中c-BEEVs升高且与血管损伤相关，研究人员采用血管紧张素II（AngII）输注构建HTN小鼠模型（皮下植入渗透压泵持续输注，剂量为1.6 mg/kg/天，共4周），探讨内皮功能障碍、EVs释放与认知损害之间的关系。在该模型中，AngII诱导HTN而不影响体重，并导致早期内皮功能障碍（表现为乙酰胆碱（ACh）诱导的脑血流（CBF）反应受损，该反应依赖于内皮一氧化氮NO），同时伴有脑脊液中CD31⁺EVs水平升高。

慢性HTN还引起血管损伤和BBB破坏，表现为髓鞘脱失、ePVS、毛细血管周细胞覆盖减少，以及皮层和海马区白蛋白外渗增加（提示BBB通透性升高）。行为学评估显示，HTN小鼠出现识别记忆（新物体识别实验，NORT）和空间工作记忆（Y迷宫）缺陷。电生理记录显示，HTN小鼠CA1神经元的微小兴奋性突触后电流（mEPSC）频率显著降低，而幅度不变，提示突触前递质释放受损。此外，生物素标记的AngII输注后海马区未见信号增强，表明认知障碍并非AngII对神经元的直接作用所致。

为进一步探究内皮EVs水平升高与认知功能障碍之间的关系，研究者开发了一种特异性敲低BEEVs的方法。首先在细胞水平验证了敲低策略的有效性：使用短发夹RNA（shRNA）靶向Smpd3基因（该基因编码中性鞘磷脂酶2，nSMase2，参与EVs释放的关键蛋白），转染N2a和SVEC4-10细胞后（即小鼠神经母细胞瘤细胞系Neuro-2a、小鼠淋巴结来源的血管内皮细胞系），EV标志物Alix和TSG101表达下降，证实shRNA可有效减少小EVs释放。随后，采用中枢微血管内皮靶向的腺相关病毒AAV9-BI30携带该shRNA，实现脑内皮特异性敲低。尾静脉注射5周后，FLAG蛋白仅表达于脑血管，证实靶向特异性；分离的脑内皮细胞中nSMase2蛋白显著降低，脑脊液中CD31⁺EVs减少，表明BEEVs释放被有效抑制。该敲低未破坏微血管结构，且未引起明显内皮细胞毒性。在此模型基础上诱导HTN，结果显示减少BEEVs可缓解HTN诱导的认知障碍：NORT表现改善。此外，降低BEEVs分泌后HTN小鼠CA1神经元mEPSC频率和幅度恢复，CA1区Schaffer侧支θ波爆发刺激诱导的长时程增强（LTP）部分恢复，树突棘密度部分恢复。值得注意的是，无HTN时单纯敲低Smpd3也会导致行为缺陷和树突棘密度降低，提示BEEVs在正常生理条件下对维持CA1兴奋性神经元的突触完整性具有重要作用。以上结果表明，HTN通过促进BEEVs释放导致突触功能障碍和认知损害，干预BEEVs释放可部分逆转这些异常，BEEVs是HTN相关认知障碍的潜在机制靶点。

图5.BEEVs介导HTN诱导的认知障碍及突触功能障碍

图6.AAV静脉注射后5周，使用纳米流式对脑脊液中的EVs进行表征

6.脑脊液BEEVs升高促进HTN模型认知障碍

多项研究表明，内皮细胞损伤会导致EV向细胞外空间释放增加。为进一步探究BEEVs对神经元功能和认知行为的影响，研究者首先用AngII处理原代脑微血管内皮细胞（BMVECs），模拟HTN体外模型。乳酸脱氢酶（LDH）检测显示，不同浓度AngII刺激的各组细胞损伤程度无差异，但AngII（1 μM和10 μM）显著降低了跨内皮电阻（TEER）。TEM和粒径分析确认了分离到的小EV的形态和大小；在此基础上，发现AngII处理的BMVECs释放了更多数量的BEEVs。已有研究表明，AngII通过1型受体依赖的NADPH氧化酶（NOX）激活诱导内皮功能障碍，进而引起氧化应激、细胞骨架重塑和EVs释放。为探索BMVECs中是否存在类似机制，用AngII处理细胞，并分别联合AngII 1型受体拮抗剂厄贝沙坦或NOX抑制剂夹竹桃麻素共处理。结果发现，厄贝沙坦可有效阻断AngII诱导的EVs释放增加；而抑制NOX甚至将EVs释放降至基础水平以下，提示NOX信号可能参与BMVECs的基础EVs生成。

随后，研究者在体外验证了BEEVs对神经元功能的影响。在原代神经元培养物中加入PKH67标记的BEEVs后，可观察到它们进入神经元胞体和神经突，并可见动态运动。暴露于经AngII处理的BEEVs后，突触素（synaptophysin）和PSD95阳性点状结构的比例以及兴奋性突触的平均密度均降低，具体表现为培养海马神经元中突触素/PSD95共定位点状结构数量减少。此外，经AngII处理的BEEVs还减少了神经元的谷氨酸释放，同时增加了γ-氨基丁酸（GABA）的释放。这些发现共同表明，经AngII处理的BEEVs可破坏突触前和突触后结构的组装，从而降低突触密度并损害兴奋性传递。

体内实验中，研究者将体外分离的BEEVs侧脑室注射入小鼠（HTN造模后1周）。注射后2小时可在皮层和海马检测到BEEVs，4周内对血压和体重无影响。BEEVs注射轻微损害认知表现但未达统计学显著性，然而显著降低了假手术组CA1锥体神经元的树突棘密度，并进一步加重HTN模型已有的树突棘密度降低。此外，BEEVs注射还减少了毛细血管周细胞覆盖，提示其对脑血管结构的损伤作用。

为验证BEEVs的独立因果作用，研究者给予小鼠重复两次侧脑室注射BEEVs，6周后行为学和尼氏染色显示认知缺陷和海马神经元损伤。支持BEEVs与神经元功能障碍之间的关联。进一步采用聚乙二醇（PEG）修饰BEEVs表面以减少细胞摄取（通过屏蔽EVs与受体细胞的相互作用），PEG化AngII-BEEVs注射小鼠维持了正常认知表现，并对海马神经元损伤具有部分保护作用。以上结果共同表明，脑脊液BEEVs在HTN相关认知障碍中发挥介导作用。

最后，为探索BEEVs介导认知障碍的潜在介质，研究者对对照BEEVs和AngII处理后的BEEVs进行蛋白质组学分析。在检测到的5,867种蛋白中，有370个差异表达蛋白（129个上调，241个下调，FDR校正后P＜0.05）。基因集富集分析（GSEA）和通路富集分析显示，与EVs生成和释放相关的通路（如内体分选复合物（ESCRT）、内体/EVs介导的运输、以及通过多泡体（MVB）分选进行的泛素依赖性蛋白分解过程）上调，其中TP53调控的代谢通路显著增强，尤其涉及YWHA家族蛋白（YWHAZ、YWHAE、YWHAG、YWHAB），这些蛋白已被报道为AD认知衰退的脑脊液早期生物标志物。相反，突触间隙结构、胆固醇代谢、细胞外基质-受体相互作用、生长因子活性等通路下调，提示脂质和能量代谢受损及血管支持减弱，可能促进神经退行性变。

图7.脑脊液中BEEVs升高促进HTN模型小鼠的认知障碍

本研究通过多中心临床队列证实，c-BEEVs是脑血管损伤的有前景的生物标志物，尤其与皮质下缺血性病变及认知障碍相关。与既往报道的sPDGFRβ、LCN2等标志物不同，c-BEEVs主要源于脑血管内皮细胞应激后的释放，与VRF及CSVD影像严重度呈强关联，且独立于Aβ和tau蛋白病理。在相同痴呆分期下，VCI患者的c-BEEVs水平持续高于AD患者，提示血管主导性损伤比AD相关神经退行性变更能激发内皮EVs释放。在混合病理的连续谱中，c-BEEVs在疾病早期即出现异常，而p-tau181主要在晚期累积；c-BEEVs可独立预测无显著p-tau181病理个体的认知下降，印证脑血管功能障碍可单独驱动认知损害，而当p-tau181占主导时其贡献不显著，可能与样本量较小或神经退行性变掩盖血管影响有关。机制上，BEEVs对突触功能具有双向作用：生理条件下维持兴奋性突触密度和谷氨酸释放；受AngII刺激后则导致突触功能障碍和树突棘密度下降，而特异性抑制BEEVs释放可部分挽救HTN诱导的认知损害。蛋白质组学显示AngII刺激的BEEVs中YWHA家族蛋白水平升高，可能构成了内皮应激、神经元功能障碍与认知衰退之间的机制性联系。

本研究存在一定局限性。以SCD为参照组而非真正健康对照，且获取认知正常者脑脊液存在伦理和操作困难，样本量较小。随访存在失访偏倚，c-BEEVs作为早期指标的结论需前瞻性纵向研究验证。使用ELISA检测ATN标志物敏感性较低。在体实验中，BEEVs注射的剂量和时机未优化，从Smpd3敲低小鼠脑脊液中直接分离BEEVs技术上仍具挑战。此外，本研究主要聚焦BEEVs对神经元的影响，其对胶质细胞和血管细胞的作用尚不清楚。

综上，c-BEEVs可作为脑血管损伤的可靠诊断标志物，联合p-tau181可作为认知下降的潜在预测指标，未来可用于痴呆早期人群的纵向监测，助力神经认知障碍的精准分层。

研究概览