慢病毒（LV）使用时应该注意什么？常见问题解答！

慢病毒是逆转录病毒科的一个属，属于单链RNA病毒，是在人类免疫缺陷I型病毒(HIV-1)的基础上发展起来的病毒载体，能够有效感染分裂细胞和非分裂细胞，整合到宿主基因组上实现长期稳定表达。我司采用4质粒，第三代293包装系统转染293细胞包装慢病毒载体。慢病毒载体的载量为6-6.5kb左右(还取决于载体本身是否有其他抗性基因或报告基因)。一般而言插入的片段如果在5kb以下产生的病毒滴度比较高，当插入的片段大于6kb的时候得到的病毒滴度往往不高。如果除去一般携带的抗性基因和报告基因，则往往只余下3kb左右的容量供目的片段的插入。

我司包装和纯化出的高滴度慢病毒载体能够感染各种不同的细胞系、原代培养细胞和体内组织细胞。慢病毒已经广泛应用于大鼠，小鼠，兔，猪和鸡等动物的局部注射和基因治疗等领域。

1.慢病毒搭载shRNA感染神经元

图1.慢病毒载体搭载的Dyrk1a段发卡RNA(shRNA)干扰新生小鼠皮层的发育和神经元的迁移(Dang T,et al,Molecular Psychiatry.2017)

图2.慢病毒搭载shRNA后干扰小鼠杏仁核内Akap5的表达，下调小鼠脑内BLA中Akap5的含量，可有效缓解小鼠出现慢性束缚造成的焦虑/抑郁样行为。(Zhou HY,et al,Biol Psychiatry.2019)
 

2.LV在肿瘤研究中的应用

图3.miR-708的过表达抑制胶质瘤细胞的生长。用LV(慢病毒)构建miR-708过表达的稳转细胞系，种植到小鼠体内，一段时间后取出异种移植瘤，瘤重量、体积和ki-67数据表明miR-708可以抑制胶质瘤的发生。(Chen Y,et al,CellDeath and Disease,2019)

慢病毒的操作使用中建议使用生物安全柜。

1.所有操作均应在生物安全柜中进行，若使用普通的超净工作台操作病毒，请不要打开风机；

2.操作病毒时要特别小心不要产生气雾或飞溅，如病毒液污染台面，请立即用70%乙醇加1%SDS溶液擦拭干净；

3.接触过病毒的枪头、离心管、培养板、培养液等需用84消毒液(1:20左右)或1%SDS溶液浸泡24h后方可丢弃；

4.离心应当是在密闭状态下进行，在生物安全柜中才能打开；

5.用显微镜观察细胞感染时应注意：拧紧培养瓶或盖紧培养板，用70%乙醇清理培养瓶/板外壁后显微镜下观察拍照，使用完成后70%乙醇清理显微镜实验台。

1.4℃短期保存(请于一周内用完)，-80℃长期保存；多次使用请分装(病毒置于冻存管，并使用封口膜封口),冻融一次损失15-20%，应避免反复冻融；

2.病毒于-80℃可保存6个月以上；储存时间超过6个月，建议使用前重新测定病毒滴度。

1.什么时候选择慢病毒?

慢病毒对分裂细胞和非分裂细胞均有感染能力，整合至细胞基因组并长期稳定表达，体内和体外实验皆适用。枢密提供ORF、miRNA、shRNA和基因编辑(CRISPR/Cas9)等慢病毒包装服务。

2.慢病毒的包装能力?

慢病毒包装能力可以达到8.5kb。随着插入基因片段增加(>3kb),包装效率下降。

3.慢病毒稀释时应注意哪些操作?

冰上解冻，使用PBS缓冲液或培养目的细胞无血清培养基稀释病毒(含血清或含双抗不影响病毒感染),混匀分装后使用。稀释后的样品尽量一次性用完。
 

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