AAV滴度测定：活体注射需回避滴度虚高！

不同的实验，对病毒注射滴度要求有差异。虚高的病毒滴度以及普遍的可能超出实验需求的高滴度注射，已经给一些实验的开展带来困扰。

病毒的真实滴度是开展后续实验的关键参数，下文以AAV相关实验列举与此相关的两个问题：

1）病毒滴度的检测；

2）实验中病毒注射滴度的确定。
 

1）枢密采用的定量工艺，已极大程度避免了使用ITR定量产生的虚高滴度，能够较好地反映真实的病毒量。虚高的病毒滴度会导致实验难以开展，无法观察到实验现象，不能够重复。

2）AAV的滴度，给出的结果是检测到的基因组拷贝数，反映的是病毒颗粒数，单位是vg/mL，即vector genomes/mL。

1) 病毒注射前调整至合适的工作浓度。

2） AAV中枢注射?

答：注射体积与核团的大小有关，一般在200-300 nL，滴度在10^12 数量级即可。用量根据随基因片段大小，启动子活性高低，表达丰度而适当调整。对大核团的侵染，则需要考虑多位点注射及大体积注射。

3） AAV外周注射？

答：请根据实验查阅文献或就产品咨询我们。

4） AAV感染小鼠后多久可以观察结果？

答：一般，2-3周可检测到较强的信号表达（胞体和纤维均可见）。部分产品，在7-14天就能观察到很好的表达。

5） AAV外源基因表达时长？

答：6个月以上，在小鼠大脑中可持续两年以上。活体组织中外源基因的表达量和表达曲线，受到具体实验条件，小鼠免疫清除强度，细胞增殖特性，病毒携载基因特性等多个因素影响。

1）小鼠和大鼠的病毒使用：一般，建议将注射滴度控制在≤ 5 x 10^12 vg/mL范围。

2）非人灵长类使用：对于此类动物的注射，需要注射高滴度，10^13 vg/mL数量级的病毒。

3）特定类别的病毒产品：如rAAV/Retro系列、1 型AAV顺跨单系列。这两类AAV均需要高滴度注射。我们的实验发现，这两类病毒能够携载的功能探针和基因有各自的适用范围，有需要可咨询我们。
 

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