【聚焦】小胶质细胞特异启动子

小胶质细胞（Microglia, MG）是广泛存在于脑和脊髓的一类巨噬细胞，在发育、稳态平衡、疾病发生和损伤修复等多个方面扮演重要的角色。作为中枢神经系统（CNS） 中的巨噬细胞，MG 亦可分为 M1 型和M2 型，且发挥不同的生理功能，形态上也有分枝状(Ramified microglia)和阿米巴状(Amoeboid microglia) 的区别。静息状态下的MG胞体较小，呈突起较长的分枝状，与神经元作用检测微环境，CNS受到炎症损伤刺激时则被激活，胞体变大，呈突起缩短的阿米巴状。因此，可通过MG形态改变辅助判断MG 是否活化。

图 1. 小胶质细胞的生活周期[Ref 1]。
 

目前，如何准确区分MG与CNS系统其他细胞以及与其他的巨噬细胞的功能，尚待更多的研究。如：① 在MG中高丰度特异表达的基因中寻找更为特异的marker；② 构建相应的转基因动物；③ 制备更特异的抗体；④ 鉴定和测试更特异的启动子；⑤ 开发搭载特定启动子的高效靶向MG的基因投递载体等。小鼠的F4/80和人的CD68/CD11b已在特定的髓系细胞得到验证，可作为MG的特异Marker，IBA1和CX3CR1的特异性和相应的抗体亦有广泛应用。本文主要介绍采用AAV（adeno-associated virus）携载特异启动子的方法研究MG功能的方法。现阶段，提高AAV介导的外源基因在小胶中的表达，主要通过AAV基因组或衣壳改造和特异启动子的开发等途径实现，具体表现为：1）改造衣壳提高转导效率，控制蛋白酶体的降解；2）采用scAAV载体以快速表达外源基因；3）使用细胞特异启动子和调控元件实现特异性高表达。
 

人的CD68基因编码110 KD的跨膜糖蛋白，在人的单核和巨噬细胞内高表达，属于清道夫受体家族（scavenger receptor），介导巨噬细胞的招募和激活，同时也是蛋白酶体/内含体相关糖蛋白( lysosomal/endosomal-associated membrane glycoprotein, LAMP )家族成员。2016年，Rosario等人采用改造的scAAV（rAAV-TM6）携带小鼠F4/80 和CD68启动子，在原代培养的microglia转导效率达到95%，并在体内选择性地标记MG。但该文中，其体内的转导效率未能得到较好的数据支持。研究者推测，一方面是因为MG的turnover的周期较长，另一方面F4/80 和CD68启动子在小鼠大脑中的强度相对弱，采用的检测方法也不够灵敏，RNA-SEQ的数据也显示这些启动子在静息CNS中并不活跃。但是，较早期的报道表明，人的CD68启动子可以在小鼠的巨噬细胞中强表达。在另一研究中，采用AAV9携载CD68驱动DREADD(Gi)在脊髓表达，结果显示DREADD仅在腰髓背角(lumbar dorsal spinal cord)的Iba1阳性细胞表达，在GFAP和NeuN阳性细胞中不表达。

Iba1( ionized calcium binding adaptor molecule 1)是巨噬细胞/小胶质细胞特异的钙离子结合蛋白。在CNS系统里，Iba1特异表达在MG中，参与MG的迁移和吞噬，在神经元、星形胶质细胞和寡树突细胞中不表达。MG激活后，Iba1的表达会上调。需要注意的是，并不是所有的 IBA1 阳性的MG都是CD68阳性。采用流式进一步表征MG，特异性抗原marker，如CD68和CD11b都是较好的选择。目前，已经成功构建的工具鼠有Iba1-EGFP、Iba1-tTA和Iba1-tTA::tetO-ChR2(C128S)-EYFP等，开发能够较好地模拟内源性Iba1表达的启动子病毒工具，将有助于扩展对MG在特定生理病理状态下功能的研究。

CX3CR1(chemokine C-X3-C motif receptor 1)是在单核巨噬细胞和MG中高表达的趋化因子受体。人的CX3CR1在in vitro/in vivo水平均可在星形胶质细胞和microglia表达，可能与发育阶段有关，其在成年小鼠的神经元中几乎是不表达的。Cx3cr1缺失的小鼠中，MG的数量显著增加，来自神经元和轴突的趋化因子fractalkine可能通过其受体CX3CR1来控制MG的激活。目前，对表达CX3CR1的MG的操作可以使用Cx3cr1-GFP和Cx3cr1-CreERT工具鼠来实现，有必要克隆和验证可兼容到病毒载体上的启动子。

图 4. FKN/CX3CR1信号通路在CNS系统中有重要作用[Ref 12]。

图 5. CX3CR1gfp:CX3CL1cherry报告品系显示CX3CR1表达MG。荧光报告蛋白并不是融合蛋白，胞浆表达反映的是相应启动子的活性[Ref 13]。
 

除上面列举的CD68，Iba1和CX3CR1三个MG特异marker，人CD11b和小鼠F4/80也被较多采用，并有利用AAV搭载这两个基因对应的启动子的报道。但是，CD11b和F4/80启动子的工作效率都有待验证和优化。值得一提的marker还有2016年报道的TMEM119 (transmembrane protein 119)，在人和鼠中均有特异的高表达，在巨噬细胞或其他免疫/神经细胞上不表达。越来越多的研究揭示出MG具有很强的功能可塑性，但在生理和病理状态下的作用还有很多细节尚未阐明。使用病毒载体靶向小胶质细胞对其进行特异性地操作，或可成为MG相关的中枢神经系统疾病治疗的有力工具。

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