【实验操作指南】神经元原代培养的步骤，病毒感染原代神经元怎么做？

1. 取胚胎期第18天（E18）的孕鼠（小鼠的cell culture可取P0-P1的新生鼠，冰上麻醉），用乙一醚或者异氟烷混合气体麻醉（注意：最好不要腹腔注射水合氯醛或者戊巴比一妥钠进行麻醉，因为腹腔注射对胎鼠影响较大）；

2. 在冰上迅速破腹取出胎鼠；

3. 将胎鼠的头剪下放在冰的dissection medium里；

4. 剥去皮肤组织和颅骨，将大脑连接小脑一起取出放在另一个装有冰的dissection medium的dish中；

5. 将dish放在冰上，将大脑分割成两半，分割时在与小脑连接的腹侧基部断开，这样便于暴露海马；

6. 拨去脑膜，用小剪刀将海马剪出。由于皮层细胞较多，此时可将接近小脑的那些皮层组织夹去（注意：不要用镊子挤捏脑组织，这样会造成大面积细胞死亡，不利于后续的培养）；

7. 在dish中将组织用小剪刀减碎；

8. 吸取含有组织碎块的dissection medium至5ul的epp管中；

9. 静置一段时间，待组织碎块沉降至底部后吸取上清（不需要吸的很干净）；

10. 在另一个5ml的epp管中按照trysin：DNA酶：digestion solution=1：1：3的体积比混合，用过滤器过滤后加入组织块中；

11. 在37度消化7-8分钟，最长不要 超过15分钟（消化时间根据酶的浓度确定），每2分钟混匀一下；

12. 此时可以在5ml的epp管中准备trysin inhibitor (TI)：dissection medium=1：4的混合液（也可以用5%FBS+Neurobasal+B27代替），在预先coating的dish中加入一定量的5%5%FBS+Neurobasal+B27混合液；

13. 将消化的组织块从37度中取出、离心，也可自然沉降，吸取上面多余的液体后，加入第12步的混合液中止消化，37度静置2-3分钟；

14. 以下步骤要求在冰上完成。静置，待组织块沉到底或者离心后，吸走上清液，然后加入DNA酶（可用dissection medium稀释），吹打；

15. 离心5-6分钟，吸走上清；

16. 加入2-3ml的dissection medium后，用移液器或者吸管将碎组织块吹散；

17. 10倍稀释后计数（10ul悬浮液+90ul台盼蓝）；

18. 按照要求浓度铺板，然后充分混匀；

注意：一般一只小鼠的脑子可以取得2 x10^7-3x10^7个神经元，体外培养3-9天的神经元均可以被慢病毒感染。
 

1. 病毒感染前，先吸取一半旧的培养基留作换液时使用，然后按照MOI=5-20的参数加入慢病毒浓缩液或者按照MOI=10^4-10^5加入AAV病毒，轻轻混匀放入培养箱中；

2. 慢病毒感染8-12小时，轻轻吸出培养基，注意不能吸干导致神经元遭受空气氧化损伤，然后迅速将已经预热好的、感染前收集的旧培养基加入；

3. 继续培养2-3天后，荧光显微镜夏观察阳性对照GFP慢病毒感染组的感染情况，一般80%以上的神经元均为阳性；

4. 3天以后的神经元可以根据实验设计进行后续工作，如western blot、qPCR、免疫组化和电生理实验等。
 

1） 病毒感染之前需要先观察神经元形态，保证神经元状态较好的前提下，然后给予病毒进行感染处理；

2） 神经元原代培养的状态非常重要，否则慢病毒会造成较多神经元死亡。另外，由于原代培养神经元较为脆弱，因为无论使用AAV还是慢病毒感染颗粒进行实验，都不建议加入polybrene增强感染。

图1.用慢病毒感染培养的海马神经元进行基因敲减实验（Dittgen et al. 10.1073/pnas.0407976101）

图2.用不同亚型的AAV病毒感染培养的皮层神经元（Virology. 2008 March 1; 372(1): 24–34. doi:10.1016/j.virol.2007.10.007）
 

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