基因修饰神经干细胞

678 人阅读发布时间：2023-08-04 15:12

神经干细胞介绍

神经干细胞（neural stem cells, NSCs）是指存在于神经系统中，能进行自我更新，并具有分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞潜能的细胞群，能产生大量脑组织细胞。研究表明，成年哺乳动物脑中存在NSCs，主要分布于海马齿状回颗粒细胞下层（subgranular zone, SGZ）和侧脑室室管膜下区（subventricular zone, SVZ）。

神经干细胞治疗的机理是：（i）患病部位组织损伤后释放各种趋化因子，可以吸引神经干细胞聚集到损伤部位，并在局部微环境的作用下分化为不同种类的细胞，修复及补充损伤的神经细胞。由于缺血、缺氧导致的血管内皮细胞、胶质细胞的损伤，使局部通透性增加，另外在多种黏附分子的作用下，神经干细胞可以透过血脑屏障，高浓度的聚集在损伤部位；（ii）神经干细胞可以分泌多种神经营养因子，促进损伤细胞的修复；（iii）神经干细胞可以增强神经突触之间的联系，建立新的神经环路。

基因修饰神经干细胞系，是通过基因工程技术，对神经干细胞进行遗传修饰，使其稳定表达特定的外源基因，如荧光蛋白、神经递质探针、钙离子探针、光敏感蛋白等，实现对细胞进行实时观察与精确操纵，应用于电生理、光遗传学、神经回路示踪等多种领域。

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图1.神经干细胞的特性。神经干细胞能够分泌神经营养因子、生长因子和细胞因子来保护神经系统；神经干细胞分化为神经元或胶质细胞前体细胞，再分化为神经元和胶质细胞来替代神经系统中丢失的细胞，在神经损伤修复中起到重要作用。（图片修改自Tang Y, et al. Cell Death Dis. 2017）

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图2.基因修饰神经干细胞产品应用举例。

应用案例

装载钙离子探针GCaMP6f的神经祖细胞

文献标题：Characterization of calcium signals in human induced pluripotent stem cell-derived dentate gyrus neuronal progenitors and mature-neurons；stably expressing an advanced calcium indicator protein

研究人员将人源诱导多能干细胞（human induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs）诱导分化为海马神经祖细胞（Neural Progenitor Cells, NPCs）。研究表明，在NPCs的长期培养过程中，钙信号是高度可变的，配体诱导的钙瞬变可能预测其产生成熟神经元的能力。为在不需要染料加载的情况下研究钙信号传导，利用睡美人转座子质粒（据报道能在人胚胎干细胞中提供稳定的转基因表达；包含嘌呤霉素抗性基因）结合转座酶，并通过嘌呤霉素（1.6 μg/mL，48 h）重复筛选转基因表达细胞，最终得到表达钙指示蛋白GCaMP6f的NPCs。作者利用BDNF（脑源性神经营养因子）、cAMP（环磷酸腺苷）、Laminin（层粘连蛋白）、Wnt3A和抗坏血酸诱导亲本和表达GCaMP6的NPCs分化，以富集海马齿状回（DG）颗粒神经元。结果显示表达GCaMP6的NPCs（P6代）可见Nestin、Sox2阳性，仍拥有干性，其分化潜能不受影响，可定向诱导分化为成熟神经元，表达MAP2，并表达海马齿状回颗粒细胞标志蛋白PROX1和CALB1。

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图3.表达GCaMP6的神经祖细胞能被诱导分化为成熟神经元。
Parental为未转入GCaMP6的对照组。

在不表达GCaMP6的亲本NPCs中加入钙离子荧光探针Fluo-4（荧光染料）指示钙信号，GCaMP6组和Fluo-4组都未见显著的自发钙瞬变，而加入三磷酸腺苷（ATP）、溶血磷脂酸（LPA）或低浓度胰蛋白酶（Try）后两组都检测到显著的钙信号。此外，离子霉素（钙离子载体，Iono）用来作为阳性对照激活钙信号，钙螯合剂EGTA用来去除背景信号。

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图4.配体诱导表达GCaMP6的NPCs产生钙信号。

研究人员分别将亲本及表达GCaMP6的NPCs诱导分化4-5周得到人DG颗粒细胞，结果显示GCaMP6组和Fluo-4组均表现出显著的自发钙信号活动。此外，向培养基中添加KCl（50 mM）引起膜电位变化后（诱发动作电位），两组分化的DG神经元完全有反应（实际上是100%，对细胞内钙浓度变化的响应），出现明显的钙信号。而添加电压门控钠离子通道抑制剂河.豚毒素（TTX，100 µM）后自发钙火花消失。

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图5. NPCs诱导分化形成DG神经元的钙信号。

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图6. TTX抑制NPCs分化的单个神经元的自发钙活动（钙瞬变）。

使用表达GCaMP6的NPCs和分化神经元的一个关键优势是能够对同一细胞进行长期、连续的钙信号研究。研究人员检测单个细胞中的自发钙振荡，结果表示NPCs分化4周后神经元中仍可见自发钙信号。这些数据证明，钙指示蛋白GCaMP6的长期表达和重复测量对培养的神经元细胞没有显著的有害影响。综上所述，本研究证明，在神经祖细胞中表达的钙离子探针GCaMP6功能稳定，长期有效。

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