【客户文章】 《Cell Reports》热休克蛋白Hsp70的抑制能通过降低神经元兴奋性及增强A型钾电流减缓癫痫的发生与发展

2019年1月2日，《Cell Reports》杂志发表了青岛大学药学院王克威教授课题组题为“Inhibition of Hsp70 Suppresses Neuronal Hyperexcitability and Attenuates Epilepsy by Enhancing A-Type Potassium Current”的研究论文。该研究发现，在海人酸 (kainic acid, KA) 诱导的急慢性癫痫中，海马神经元中Hsp70的异常表达导致电压门控钾离子通道Kv4降解及神经元异常放电，敲低或抑制Hsp70具有显著的抗癫痫效果。该工作得到国家自然科学基金、科技部973项目的资助。

 

作者首先观察了Hsp70在KA诱导的癫痫中的表达谱，发现在KA诱导的癫痫模型中，Hsp70的表达异常升高 (Fig. 1B)。为了进一步研究Hsp70在癫痫中的作用，作者采用shRNA敲低Hsp70的表达并观察大鼠癫痫行为。结果显示，Hsp70敲低可明显减缓大鼠KA诱导的癫痫 (Fig. 1C-F)。

接下来，作者又采用Hsp70的两个抑制剂 2-phenylethynesulfonamide (PES)和 VER-155008 (VER) 来抑制Hsp70并观察大鼠癫痫行为及脑电EEG。结果显示，连续给药7天可显著缓解KA诱导的急性癫痫，同时大鼠异常脑电也得到恢复 (Fig. 2A-F)。在大鼠慢性癫痫形成后，连续7天给予PES可明显降低大鼠每天癫痫发作次数，同时也能明显减少痫样放电总时间 (Fig. 2G-K)。

癫痫是由于大脑神经元突发性异常放电所导致的，为了研究Hsp70减缓癫痫发生发展的作用机制，作者检测了Hsp70抑制剂对神经元兴奋性的影响。结果显示，Hsp70抑制剂可明显减少海马神经元动作电位的发放，同时增加第一个动作电位发放的潜伏期 (Fig. 3A-E)。

有研究报道，颞叶癫痫发作过程中海马锥体神经元兴奋性的增加是由于A型钾电流（A-type potassium current, IA）的减弱。因此作者又进一步检测了Hsp70抑制剂对IA的影响，PES或VER孵育海马神经元4 h可明显增强IA，而并不影响其门控特性 (Fig. 3F-J)。

Figure 3. Reduction of Neuronal Excitability and Enhancement of A-Type Current by Hsp70 Inhibition
 

在海马及皮层神经元中，IA主要由Kv4.3和Kv4.2通道编码，为此，作者又检测了KA诱导的癫痫或Hsp70抑制剂对Kv4蛋白的影响。结果显示，在侧脑室注射KA后，Kv4.2及Kv4.3的表达明显降低，Hsp70抑制剂能够挽救Kv4的表达 (Fig.4A-C)。进一步研究显示，Hsp70抑制剂增加Kv4的表达是通过抑制其降解 (Fig.4D)。

Figure 4. Hsp70 Inhibition Reduces Kv4 Channel Degradation Caused by KA-Induced Seizures.
 

为了进一步研究KA诱导的癫痫中Kv4通道降解的分子机制，作者采用CoIP技术检测Hsp70与Kv4的结合情况，结果显示Hsp70能够与海马组织中Kv4 a亚基结合，然而却不能结合在HEK293细胞中单独转染的Kv4蛋白 (Fig.5A-B)，提示Hsp70可能直接结合于Kv4离子通道的辅助亚基KChIP。为了验证这一假说，作者又检测了Hsp70与KChIPs之间的相互作用。CoIP结果显示，Hsp70能够与具有独特N端KID结构域 (N-terminal Kv4 inhibitory domain) 的KChIP4a结合 (Fig. 5C)。进一步的研究显示Hsp70抑制剂能够减少KChIP4a的降解以及KChIP4a依赖的Kv4蛋白的降解 (Fig. 5D)，同时，KA诱导KChIP4a蛋白表达减少，而Hsp70抑制剂能够挽救KChIP4a的表达 (Fig. 5E)。

为了研究KChIP4a在体敲低在癫痫发生发展中的作用，作者针对于KChIP4a构建了shRNA。shRNA敲低KChIP4a表达后可显著缓解大鼠KA诱导的急性癫痫 (Fig. 5G-I)。

Hsp70抑制剂PES和VER能够同时抑制结构型Hsc70和诱导型Hsp70蛋白的活性，为了研究两者在Kv4-KChIP4a复合体降解中的作用，作者采用siRNA来敲低Hsc70和Hsp70的表达，并检测敲低后KChIP4a降解的情况。结果显示，Hsc70和Hsp70敲低后均能减少KChIP4a的降解，同时，敲低E3连接酶CHIP（C terminus of Hsp70-interacting protein, Hsp70/Hsc70协同伴侣分子）也能够明显减少KChIP4a的降解 (Fig. 6A-B)。Hsp70/Hsc70-CHIP复合体启动蛋白酶体和溶酶体蛋白降解途径，而作者发现蛋白酶体抑制剂MG132而非溶酶体抑制剂氯喹能够抑制KChIP4a的降解 (Fig. 6C)，说明Hsp70/Hsc70-CHIP复合体直接靶向KChIP4a进行蛋白酶体降解。

Figure 6. Co-chaperone CHIP of Hsp70 Targets KChIP4a for Proteasomal Degradation.
 

最后作者又确定了KChIP4a特有的N末端NID结构域为Hsp70的结合区域 (Fig. 7A-D)，通过构建不同的突变体或截断体发现，residues 11-18 (VLIVIVLF)为其结合的氨基酸基序 (Fig. 7E-G)，Hsp70抑制剂及蛋白酶体抑制剂MG132明显减少VLIVIVLF介导的KChIP4a降解 (Fig. 7H, Fig. S7)。

抑制热休克蛋白Hsp70减缓癫痫的发生与发展，是通过降低神经元兴奋性及增强A型钾电流来介导的。该项工作中为了观察Hsp70敲低大鼠的癫痫行为，以及研究KChIP4a在体敲低在癫痫发生发展中的作用，构建的针对Hsp70和KChIP4a的病毒载体“rAAV-U6-shRNA-CMVmCherry-pA”来源于枢密科技，在实验中完美地实现了Hsp70和KChIP4a的敲低。

 

如有相关需求，或了解更多产品和服务，欢迎扫码咨询！