新一代无损伤钙离子探针“GCaMP-X”

许多重要的生物学过程如增殖、转录、代谢、胞吐、收缩和凋亡等都有Ca2+的参与，因此，人们付出了巨大的努力来开发和改进分子工具来监测和量化细胞Ca2+的时空动态。利用基因编码钙离子指示剂(GECIs)进行荧光成像，在细胞群、单个细胞或亚细胞水平上检测Ca2+取得了快速进展。钙离子成像技术是利用可以感应Ca2+浓度的钙离子指示剂，检测的是细胞或组织中Ca2+的浓度变化，将钙浓度变化转化为荧光信号，从而使细胞电活动转化为可记录的光信号。钙离子指示剂分为两种，一种为化学指示剂，另一种为现在普遍使用的遗传编码指示剂，例如GCaMP。GCaMP由绿色荧光蛋白（green fluorescent protein , GFP）、钙调蛋白（calmodulin, CaM）和肌球蛋白轻链激酶的一段肽段序列M13构成。当有Ca2+结合CaM时，CaM发生构象变化，其轻链区可以结合M13，致使GFP在特定波长的光照下其发色团的质子化作用增强，吸光度增加从而使GFP发出强烈的荧光。

然而，据报道GCaMP在多个方面造成了意想不到的“副作用”，主要是GCaMP引起的细胞损伤。GCaMP可能损害细胞和组织的整体健康，例如GCaMP2转基因小鼠心脏的心肌肥大【1-2】，以及神经元的细胞毒性或死亡【3-4】；在GCaMP5转基因小鼠的海马神经元中观察到放电频率的增加【5】。这些副作用似乎与GCaMP在细胞核内的异常堆积密切相关，通常伴随着神经元内Ca2+动力学的衰减【3-4,6】。

2018年4月17日，北京航空航天大学生物医学工程高精尖创新中心刘晓冬研究组在《Nature Communications》在线发表了题为“Improved Calcium Sensor GCaMP-X Overcomes the Calcium Channel Perturbations Induced by the Calmodulin in GCaMP”的论文。该研究首次揭示了含有CaM的GCaMP干扰了L型钙通道(CaV1)的门控和信号传导，破坏Ca2+动力学和基因表达，并通过GCaMP氮端引入能够特异结合apoCaM的保护元件，设计出了新一代无损伤钙离子探针——GCaMP-X，有效地保护了依赖于CaV1的兴奋-转录耦合免受干扰，同时仍表现出部分GCaMP的优良Ca2+感应特性。

 

CaV1.3是神经元表达的CaV1通道的一个主要亚型，与细胞核内的转录信号紧密耦合。作者发现，GCaMP能与CaV1.3结合，导致CaV1.3的门控显著增强，钙离子内流增加（图1）。

图1. GCaMP干扰神经元L型电压门控钙通道（CaV1.3）
 

作者还发现，GCaMP也会干扰CaM正常情况下响应CaV1.3钙信号的核迁移过程，长时程表达时引发GCaMP异常核聚集。入核GCaMP扰乱了转录因子CREB信号通路的正常运转，导致神经元退化和凋亡（图2）。

图2. GCaMP导致神经元退化和凋亡
 

作者在GCaMP氮端引入了特异性apoCaM保护元件，合成了新一代钙离子探针——GCaMP-X。GCaMP-X有效地解决了有害核积累、急性和慢性Ca2+失调、转录信号异常和细胞形态异常等问题，同时仍表现出GCaMP的优良Ca2+感应特性（图3）。

作者用电穿孔法在机械敏感的外毛发细胞中转染GCaMP6m或GCaMP6m-XC，在短时间的细胞培养中（1天，DIV1），GCaMP6m-XC与GCaMP6m在监测Ca2+信号时无明显差异。而在较长时间的细胞培养( 3天，DIV3)中，GCaMP6m的副作用(例如干扰外毛发细胞中的CaV1.3)将出现。将100、300或500 ms的射流脉冲施加到细胞上，与表达GCaMP6m-XC的细胞相比，GCaMP6m表现为较弱的Ca2+信号反应，引起了Ca2+信号的衰减，而GCaMP6m-XC避免了这个问题（图4）。

作者进一步在GCaMP碳端加入定位序列，如：测量近膜钙信号的GCaMP-XM探针，以及特异性定位于细胞核的GCaMP-XN探针，以实现监测胞质、膜下和核钙信号，满足不同实验研究的需要。新一代无损伤探针GCaMP-X有效地解决了传统GCaMP探针的弊端，能够安全无损、长时程、精准、特异、多细胞器的定量钙信号监测。这项研究也对未来基于CaM的分子工具的设计有指导意义。

刘晓冬课题组致力于如下几个方面的研究：1）电压门控钙通道CaV门控-信号耦联（如兴奋-转录耦联）机制及调控；2）基于新型钙探针GCaMP-X的长时程、亚细胞钙信号定量监控；3）感觉刺激响应型钙通道TRP的结构-功能研究；4）重要钙通道的病生理关联。此论文是该实验室继前期工作（《自然》Nature 2010；《细胞•报告》 Cell Reports 2015；《e生命》eLife 2017；及《自然•通讯》 Nature Communications 2018等）的最.新研究进展。该项研究得到了国家自然科学基金委、北京市自然科学基金委、清华大学麦戈文脑科学研究所等方面的支持。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-018-03719-6

参考文献：

1. Tallini, Y. N. et al. Imaging cellular signals in the heart in vivo: Cardiac expression of the high-signal Ca2+ indicator GCaMP2. Proc. Natl Acad. Sci. 103, 4753–4758 (2006)

2. Colomer, J. M., Terasawa, M. & Means, A. R. Targeted expression of calmodulin increases ventricular cardiomyocyte proliferation and deoxyribonucleic acid synthesis during mouse development. Endocrinology 145, 1356–1366 (2004).

3. Tian, L. et al. Imaging neural activity in worms, flies and mice with improved GCaMP calcium indicators. Nat. Methods 6, 875–881 (2009).

4. Resendez, S. L. et al. Visualization of cortical, subcortical and deep brain neural circuit dynamics during naturalistic mammalian behavior with headmounted microscopes and chronically implanted lenses. Nat. Protoc. 11, 566–597 (2016).

5. Gee, J. M. et al. Imaging activity in neurons and glia with a Polr2a-based and cre-dependent GCaMP5G-IRES-tdTomato reporter mouse. Neuron 83, 1058–1072 (2014).

6. Dombeck, D. A., Harvey, C. D., Tian, L., Looger, L. L. & Tank, D. W. Functional imaging of hippocampal place cells at cellular resolution during virtual navigation. Nat. Neurosci. 13, 1433–1440 (2010).

枢密科技GCaMP-X产品列表：
 

GCaMP-X优势：

1. 精准、特异且安全无损；

2. 特别适合超长时程（≥4周）钙信号的监测。

测试结果：

测试病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m-XC，滴度：1.0x10^12，血清型：2/9；

对照病毒：AAV-hSyn-GCaMP6m，滴度：1.2x10^12，血清型：2/9；

注射区域：在同一只小鼠左脑皮层区域注射GCaMP6m，右脑皮层区域注射GCaMP6m-XC；

注射量：各100 nl。

图一：同一只小鼠左右脑皮层分别注射GCaMP6m和GCaMP6m-XC病毒，表达3周时长，左脑皮层神经元出现GCaMP6m显著进核现象，而右脑皮层神经元GCaMP6m-XC无进核现象。

图一、 病毒注射3周后表达状态对比（刘晓冬课题组提供）
 

图二：步骤同上，表达13周时长，左脑皮层神经元GCaMP6m显著进核，而右脑皮层神经元GCaMP6m-XC依然无进核现象。

注意：低滴度GCaMP6m-XC表达量相对较低，可能会不利于在体双光子实验，推荐使用者使用10^13高滴度病毒，可有效提高表达量，有利于在体双光子实验。

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