电压探针类、光遗传类、化学遗传类神经干细胞

电压探针类神经干细胞

        神经细胞的膜电位变化是神经细胞活动最基本的信号，当膜电位变化时，细胞膜上镶嵌的许多蛋白质分子都会改变形状，这类随膜电位改变形状的蛋白分子也叫电压敏感蛋白。利用基因工程的办法将电压敏感蛋白和荧光蛋白连接起来，当膜电位改变时，电压敏感蛋白的改变就会影响荧光蛋白的结构，从而改变了后者的发光特性。这样就可以利用荧光来看膜电位变化了。

        ArcLight属于基因编码荧光指示蛋白(genetically encoded fluorescent voltage indicators，GEVIs)，由电压敏感蛋白和荧光蛋白组成，它能随着神经细胞的电压变化而发出荧光。基因编码的电压指示器能告诉我们细胞膜电位的波动，相比于钙指标，更能直接反映神经元的活性。这种感应器与传统的电生理技术不同，能在同一时间分析多种定义神经元的活性。

图1.电压探针ArcLight原理示意图。Arclight蛋白由电压敏感蛋白和pH敏感的绿色荧光蛋白(pHluorin)组成，细胞膜电位发生去极化时，荧光强度减弱。
(图片修改自Wang W,Kim CK,Ting AY.Nat Chem Biol.2019.)

图2.表达ArcLight(A173/Q175)电压探针的小鼠皮质神经元。

        ArcLight靶向表达于小鼠皮质神经元胞体及树突，能够记录诱发的动作电位，光记录与电记录结果一致。(图片引自Han Z,Jin L, Platisa J, et al.,PLoS One.2013.)

光遗传类神经干细胞

        光遗传技术(optogenetics)是指利用基因工程方法将光敏感蛋白导入神经元，通过特定波长的光靶向激活或抑制细胞的发放电活动。光敏感蛋白还可以顺着感染的神经元胞体向突触生长，甚至跨越一级突触向下一级神经元的胞体，因此光遗传学技术又具有细胞空间投射的特异性，这对于神经环路中各脑区特定细胞群的调控具有无.与伦比的精准性。

图3.光刺激和电刺激。

        通过特定波长的光靶向激活或抑制实现对特定细胞甚至特定投射的研究。电刺激具有较高的时间分辨率，但空间分辨率和细胞特异性较差，不能选择性地对某一类型的细胞进行研究。

图4.光敏感通道作用原理示意图。

        视紫红质通道蛋白(channelrhodopsin-2,ChR2)，是常用的光激活类蛋白，将ChR2表达于神经元，用蓝色激光打开ChR2通道，Na+大量内流，导致神经元兴奋；嗜盐菌紫质(NpHR)是常用的光抑制类蛋白，黄色激光能够打开NpHR，使Cl-内流，抑制神经元兴奋。

图5.利用ChR2引发神经元放电。（图片引自Wang L,Chen IZ,Lin D.Neuron.2015.）

化学遗传类神经干细胞

        化学遗传学(Chemical genetics)是对某些生物大分子进行改造，使其不能与原本的配体结合，而与研究者指定的药物结合。在细胞中表达改造后的生物大分子，通过添加或去除指定药物控制细胞活动。DREADDs(Designer Receptor Exclusively Activated by Designer Drugs)由G蛋白偶联受体(GPCR)改造而来，无法结合原本的配体，只接受外源性的配体的信号，并激活相应的信号通路，从而引发细胞不同的兴奋性变化。

图6.DREADDs原理示意图。

        将神经细胞膜上GPCR改造得到DREADD,使其无法结合原本的神经递质配体，加入相应的小分子药物，引发神经细胞不同的兴奋性变化。(图片修改自Benchiling)

图7.hM4D(Gi)与hM3D(Gq)作用原理示意图。

        hM4D和hM3D分别由由人类M4毒蕈碱受体亚型M4和M3改造而来，改造后无法和原本的配体结合，但能被叠氮平-N-氧化物(clozap-ine-N-oxide，CNO)诱导激活。在神经元细胞中表达hM4D和hM3D，可以通过CNO抑制或激活神经元。

图8.hM4Di与hM3Dq控制人类多能干细胞来源的多巴胺能神经元。(图片引自Chen Y,et al.,Cell Stem Cell.2016.)

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