【客户文章】《J Neurochem》湘雅医院黄长盛团队发现AURKB在大鼠脊髓小胶质细胞活化和神经病理性疼痛中有重要作用

        神经病理性疼痛是由周围或中枢神经损伤或全身性疾病引起的慢性疼痛状态。它影响了全球6.9％–10％的人口，并且目前可用的治疗方法仍然效果不佳。大多数治疗方法都针对疼痛通路中的神经可塑性。然而，关于脊髓小胶质细胞在神经病理性疼痛中的作用研究较少，并且很少有有效控制脊髓小胶质细胞活化的靶标。

        近日，中南大学湘雅医院麻醉科黄长盛教授团队在《Journal of Neurochemistry》上在线发表了题为“Targeting aurora kinase B alleviates spinal microgliosis and neuropathic pain in a rat model of peripheral nerve injury”的文章。在本研究中发现，极光激酶家族中的极光激酶B（AURKB）在大鼠脊髓小胶质细胞活化和神经病理性疼痛中有着重要作用，AURKB可能是治疗神经病理性疼痛的有效靶点。已有的基础研究中发现的治疗神经病理性疼痛的靶点能成为临床治疗靶点的非常有限，本研究在SD大鼠上已经验证了AURKB特异性抑制药物AZD1152对治疗外周神经损伤后所导致的神经病理性疼痛的有效性, 提示了AURKB可作为可靠的治疗靶点。

1. 慢性坐骨神经缩窄伤(CCI)模型能成功诱导神经病理性疼痛和脊髓小胶质细胞活化

        首先，课题组对SD大鼠行坐骨神经慢性损伤（CCI）手术或假手术（sham）构建神经病理性疼痛模型，通过热痛和机械痛测定发现CCI术后疼痛阈值明显降低确认疼痛模型构建成功（图1 a-b）。并且发现小胶质细胞典型相关基因Aif1,Csf1r的mRNA水平在CCI术后第三天开始表达上调并持续到术后第十四天，提示小胶质细胞的活化（图1c）。

2. CCI术后脊髓中AURKB表达持续上调

        接下来，课题组检测了CCI术后1、3、7、14天的极光激酶家族的三个激酶AURKA、AURKB、AURKC在脊髓中的表达水平改变，发现只有AURKB在CCI术后从第三天开始表达水平升高并持续至第十四天，进一步在蛋白表达水平上对之做了验证（图1d-g），并且还发现AURKB的表达变化趋势与小胶质细胞典型相关基因Aif1,Csf1r的表达变化趋势相似，提示AURKB参与CCI后的神经病理性疼痛的病理过程，及可能参与脊髓小胶质细胞活化的过程。

Figure 1. Chronic constriction injury (CCI) induces neuropathic pain and leads to sustained up-regulation of AURKB expression in the spinal cord

3. 过表达AURKB能诱导大鼠脊髓小胶质细胞活化和疼痛超敏反应

        那么下一步，课题组对AURKB这个靶点进行干预，首先通过慢病毒过表达AURKB，发现过表达AURKB引起了脊髓中小胶质细胞的标记物CD11b的表达显著上调，但是星形胶质细胞的标记物GFAP和少突胶质细胞前体细胞（OPC）的标记物NG2的表达没有明显变化（图2b-f），表明过表达AURKB可引起脊髓中小胶质细胞活化，但是不影响星形胶质细胞或OPC。免疫荧光染色结果显示，AURKB过表达后，脊髓背角的小胶质细胞显示出激活的细胞形态，并同时有小胶质细胞数量增加，进一步证实AURKB过表达诱导了脊髓小胶质细胞的活化（图2g-h）。并且课题组发现，过表达AURKB后能诱导大鼠的机械痛和热痛的疼痛超敏反应（图i-j）。

4. 敲减AURKB能够抑制CCI诱导的脊髓小胶质细胞的活化

        接下来，通过构建腺相关病毒（AAV）敲减AURKB，课题组发现敲减AURKB后对于极光激酶家族的另外两个酶AURKA,AURKC的基因表达水平没有显著影响，但AURKB的表达水平明显降低，可见敲减病毒的特异性和有效性。然后发现敲减AURKB后显著降低CCI诱导的CD11b的蛋白表达水平的上调，但是对于CCI后的GFAP和NG2没有影响（图3b-g）。同时免疫荧光结果可见敲减AURKB后能够使CCI所诱导的小胶质细胞的激活态变为静息态，并且抑制CCI后导致的小胶质细胞数目增多（图3h-i）。由此可见，敲减AURKB后能够抑制CCI诱导的脊髓小胶质细胞的活化。

5. 敲减AURKB能缓解CCI大鼠的神经病理性疼痛

        课题组发现给大鼠鞘内注射构建的AAV病毒敲减AURKB后，对于CCI大鼠，注射阳性病毒组的大鼠与对照病毒组的大鼠相比，机械痛阈值和热痛阈值都明显提高，说明疼痛得到了明显缓解（图4）。

6. AURKB敲减后CCI大鼠脊髓中的差异基因表达和富集分析

        为了更进一步的探索AURKB敲减后CCI大鼠疼痛缓解的可能机制，课题组对利用AAV病毒敲减AURKB后的大鼠腰膨大脊髓标本进行了全基因mRNA转录组测序(RNA-seq)。测序结果显示，AURKB敲减组与对照组相比，有1727 (87.10%)个下调基因，256(12.90%)个上调基因（fold-change ≥ 2, FDR ≤ 0.05），对这1983个差异表达基因进行GO分析和KEGG通路富集分析，发现富集排名前30的KEGG通路中有很多和小胶质细胞活化密切相关，并且在这些通路中的差异表达基因主要都为下调基因（图5）。

Figure 5. Differential gene expression and enrichment analysis in the spinal cord of CCI rats after AURKB knockdown based on RNA sequencing

7. CCI大鼠脊髓AURKB敲减后有大量的小胶质细胞活化相关基因和疼痛相关基因的表达下调

        课题组进一步将测序结果中的差异表达基因与已有的小胶质细胞基因数据库进行匹对，发现1983个差异表达基因中有889个是小胶质细胞基因，其中有836 (94.04%) 个基因下调，再通过qRT-PCR验证了其中与小胶质细胞活化的多个生物学过程相关的基因的下调（图6a-e）。团队还发现许多下调的基因也是治疗神经病理性疼痛的已知靶标。与AmiGO2 GeneOntology 在线数据库上的已知的177个大鼠疼痛相关基因比较后发现下调基因中有23个大鼠疼痛相关基因，挑选其中几个典型基因进行了qRT-PCR验证(图6f-g)。

Figure 6. AURKB knockdown caused down-regulation of numerous microgliosis- and pain-related genes in the spinal cord of CCI rats

8. AURKB抑制剂对CCI诱导的神经病理性疼痛具有治疗效果

        为了更进一步知道AURKB作为靶点的可药用性，课题组采用了AURKB的特异性抑制剂AZD1152-HQPA，对CCI大鼠进行鞘内注射，发现能明显提高CCI大鼠的机械痛和热痛的阈值，可见用药物抑制AURKB是治疗大鼠CCI后的神经病理性疼痛的可行方法（图7）。

总结

        在此项研究中，课题组使用了枢密的工具病毒AAV（rAAV-U6-shRNA(AURKB)-CMV-EGFP-WPRE-pA）成功敲减了AURKB，对整个研究具有重要贡献。该课题组首次发现了AURKB在调节CCI诱导的脊髓小胶质细胞活化和神经病理性疼痛中的关键作用。并且研究表明，AURKB可能是开发针对周围神经损伤后神经病理性疼痛的新型镇痛药的有效治疗靶标。

原文链接：
Targeting aurora kinase B alleviates spinal microgliosis and neuropathic pain in a rat model of peripheral nerve injury - Shen - 2020 - Journal of Neurochemistry - Wiley Online Library

如有相关实验需求，或了解更多产品服务，欢迎咨询我们！