【客户文章】《J Exp Med》南京医科大学卢应梅教授、韩峰教授与浙江大学陈忠教授合作发现癫痫产生的新机制

        癫痫（Epilepsy），是一种以大脑神经元突发性异常放电为主要特点的神经疾病。流行病资料显示，我国癫痫的总体患病率为7.0‰（约900万癫痫患者），同时每年新增癫痫患者约有40万。癫痫的致病因素复杂多样，主要包括脑部疾病、遗传因素和全身或系统性疾病等。迄今为止，血管内皮源性危险因素是否导致癫痫发生鲜见报道。血管内皮源性危险因素是否是导致癫痫的重要病因之一？

        近日，南京医科大学基础医学院卢应梅教授课题组与药学院韩峰教授、浙江大学药学院陈忠教授合作在《Journal of Experimental Medicine》上在线发表题为“Endothelial Cdk5 deficit leads to the development of spontaneous epilepsy through CXCL1/CXCR2-mediated reactive astrogliosis”的研究成果。该研究首次报道血管内皮源性危险因素是导致癫痫发生的重要病因之一。血管内皮特异性敲除周期素依赖性激酶5（cyclindependent kinase 5, Cdk5）诱发血管内皮细胞趋化因子配体1（chemokine (C-X-C motif) ligand 1,CXCL1）分泌增加进而作用于星形胶质细胞的趋化因子受体2（chemokine (C-X-C motif) receptor 2,CXCR2），导致星形胶质细胞的功能障碍，进而引起神经元异常放电。该成果丰富了癫痫的机制研究，提示血管内皮上的Cdk5可能是治疗癫痫的潜在靶点，为癫痫的治疗提供新的思路。

        不同细胞类型间通讯异常介导神经精神疾病机制研究备受关注，但是关于血管内皮上的Cdk5在神经系统疾病中的功能知之甚少。研究团队围绕血管内皮上的Cdk5如何引起星形胶质细胞的增生以及自发性癫痫，进行了如下研究：

1、血管内皮细胞敲除Cdk5以后可以诱发自发性癫痫

         研究者发现血管内皮细胞特异性敲除Cdk5可以导致自发性癫痫。团队成员进一步通过脑血管内皮特异性的病毒侵染以及采用他莫昔芬诱导敲除确认血管内皮Cdk5参与自发性癫痫病理进程。癫痫发生的主要机制是神经元兴奋与抑制的失衡，研究人员发现脑血管内皮细胞敲除Cdk5的小鼠模型中，海马CA1区锥体神经元的兴奋性显著增加，微透析的结果进一步提示兴奋性神经递质谷氨酸含量升高，然而PPR试验以及Spine分析的结果表明突触前神经递质释放量以及突触后树突棘密度均没有改变，那么影响神经元兴奋性的原因是什么呢？

图1. 血管内皮细胞特异性敲除Cdk5诱导自发性癫痫的产生
 

2、内皮细胞上Cdk5的缺失可以引起星形胶质细胞发生增生和激活，并降低星胶上谷氨酸的摄取

        进一步，通过膜片钳研究方法，研究者发现海马CA1区星形胶质细胞上的谷氨酸转运体的电流变化是可能引起神经元异常兴奋的主要因素。研究者利用血管内皮Cdk5缺失的小鼠研究模型，在海马区注射AAV相关病毒过表达谷氨酸转运体1（glutamate transporter 1, GLT1）以及采用GLT1的激活剂头孢曲松的研究手段，进一步确证血管内皮Cdk5缺失导致星形胶质细胞上的谷氨酸转运体功能受损，进而不能有效的转运突触间隙的谷氨酸从而导致神经元的兴奋性增加。

3、内皮细胞敲除Cdk5以后可以诱导CXCL1的分泌增加

        团队成员利用转录组学以及分子生化手段，证明内皮细胞Cdk5缺失导致内皮细胞的CXCL1分泌增加。并且通过免疫组化结合western blot以及电镜证明内皮细胞敲除Cdk5以后并没有引起血脑屏障的破坏。也就是证明了血脑屏障不是导致癫痫发作的一个原因。主要是内皮上的CXCL1分泌增加引起了星胶的增生和激活以及神经元兴奋性的增加。

4、在Cdh5Cre;Cdk5f/f的小鼠中沉默CXCL1以后可以降低癫痫的易感性以及神经元的兴奋性

        针对CXCL1诱导星胶增生激活以及神经元兴奋的分子机制，研究人员利用药理学和病毒的手段在体沉默内皮细胞上的CXCL1发现可以降低敲除小鼠的神经元的兴奋性以及PTZ诱导的癫痫的易感性。

5、敲除小鼠分泌的CXCL1通过与星形胶质细胞的CXCR2结合，引起了星胶的增生和激活以及神经元兴奋性的增加

        接下来，利用AAV分别敲除神经元和星形胶质细胞上的CXCR2受体，探究CXCL1引起星胶增生激活以及神经元兴奋性增加的机制。研究发现CXCL1通过与星形胶质细胞上的CXCR2结合引起星形胶质细胞的谷氨酸转运体的功能障碍。

总结

        在此项研究中，团队使用了枢密科技的工具病毒（rAAV-CaMKIIα-Cre-WPRE-pA, rAAV-GFAP-Cre-WPRE-pA, rAAV-U6-Loxp-CMV-mCherry-Loxp-shCxcr2,rAAV-Efla-DIO-GLT1-mCherry-WPRE-pA），分别在海马区的锥体神经元和星形胶质细胞上过表达GLT1或者沉默Cxcr2发现：1）星形胶质细胞上GLT1的功能缺失引起了神经元兴奋性的增加以及癫痫易感性的增加；2）敲除小鼠内皮细胞分泌的CXCL1不是直接经由锥体神经元的CXCR2起作用；3）血管内皮细胞敲除Cdk5后引起了血管内皮上的CXCL1的分泌增加，通过与星胶上的CXCR2结合引起了星胶上谷氨酸转运体的功能障碍，进而导致了神经元的兴奋性增加并介导了癫痫的病理性进程。

        南京医科大学基础医学院卢应梅教授与药学院韩峰教授、浙江大学药学院陈忠教授为论文通讯作者，浙江大学硕博连读研究生刘秀秀为论文第一作者。此研究获得国家重点研究开发项目，国家自然科学基金以及南京医科大学科技发展基金项目支持。


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