Nature Communication| 浙大陈忠教授团队解析颞叶癫痫发作中异常放电扩散的新机制

        癫痫是一种常见的中枢神经系统疾病，全球患病率为0.7-1%，主要临床表现为伴有脑内异常同步化放电引起的反复不自主发作。癫痫发病机制非常复杂并未完全阐明，传统观点认为癫痫发作是由脑内“兴奋抑制失衡”所导致。基于此理论，尽管多年来针对离子通道和促GABA能神经元功能等主要靶点的新型抗癫痫药物不断被发明及应用，但是依然有大约30%的癫痫患者对多种抗癫痫药物耐受而发展为难治性癫痫。颞叶癫痫是最常见的难治性癫痫类型，其中以海马为常见病灶的颞叶癫痫患者75%最终会发展为难治性癫痫。手术切除颞叶区病灶可以让部分难治性颞叶癫痫患者短期内不再发作，然而适合手术的患者有限，而且即使经历术后仍旧有三分之一的患者3-5年内癫痫复发。并且，颞叶癫痫手术切除的区域（海马、杏仁核等边缘系统结构）与学习记忆、情感认知密切相关，患者在术后会出现多种认知功能障碍及并发症。越来越多的研究表明癫痫的形成是一种环路水平的病理变化，因此解析脑内癫痫相关神经环路并以此研发新的治疗策略和药物靶点是目前癫痫研究的热点。

        近日，浙江大学药学院陈忠教授团队在《NatureCommunication》上在线发表了题为“A disinhibitory nigra-parafascicular pathway amplifies seizure in temporal lobe epilepsy” 的研究成果。该研究首次揭示了黑质网状核GABA能神经元在颞叶癫痫发作中异常放电扩散的作用及机制，该发现加深了对癫痫异常网络形成的认识，并为临床颞叶癫痫的精准药物治疗靶点研究提供了重要的实验依据。

        目前，临床和实验研究发现癫痫引起的异常的病理改变不仅仅局限于癫痫灶点及其附近区域，边缘脑区也参与了全脑网络异常的复杂性现象。因此，如果能解析颞叶癫痫的异常网络是如何传播的，这将有助于为颞叶癫痫提供更精准及更有效的治疗。黑质网状部（substantia nigra pars reticulata, SNr）位于中脑部位，其主要特征是抑制性GABA神经元富集，被认为与多种癫痫类型有关，但是SNr参与调控癫痫形成的相关的神经环路及其机制仍然不清楚。因此本研究主要利用小鼠颞叶癫痫模型，结合在体神经元记录、钙信号光纤记录，光遗传学调控，以及离体电生理和逆向跨单突触病毒追踪等多种实验手段，探索SNr的GABA能神经元在颞叶癫痫中的作用及机制。

1. 颞叶癫痫发作激活SNr的GABA能神经元及其主要亚型PV神经元

        首先为了探索颞叶癫痫发作对SNr的抑制性GABA能神经元的影响，研究人员使用在体神经元记录和钙信号光纤记录的方式，分别检测了SNr的GABA能神经元及其主要亚型小清白蛋白亚型（PV）神经元在颞叶癫痫发作过程中的活动变化。研究人员利用小鼠海马电点燃癫痫模型，发现在电刺激海马CA3诱发癫痫发作时，在体神经元记录显示SNr的GABA能神经元发放频率迅速增加。同时，钙信号光纤记录显示SNr的PV神经元的钙信号在癫痫形成过程中也逐渐增加。以上结果提示SNr的GABA能神经元的活化可能与颞叶癫痫形成有关。

2. SNr的PV神经元双向调控颞叶癫痫的发作扩散

        在小鼠海马电点燃癫痫模型中，研究人员利用光遗传学手段选择性地激活SNr的GABA能神经元或者PV神经元，发现小鼠到达癫痫全身性发作的时间缩短，癫痫发作脑电持续时间延长，但不改变癫痫灶点发作起始的阈值，结果提示激活SNr的GABA能神经元或PV神经元加速颞叶癫痫的发作扩散过程。而选择性地抑制SNr的PV神经元，发现可以减缓颞叶癫痫的发作扩散进程。同时，研究人员进一步使用药理遗传学手段验证SNr的PV神经元在海人藻酸诱发的急性或者慢性自发的颞叶癫痫中的作用。在KA诱发的急性颞叶癫痫模型中，选择性地抑制SNr的PV神经元，发现动物到达癫痫全身性发作和持续性癫痫发作的潜时延长。在KA诱发的慢性自发的颞叶癫痫模型中，选择性地抑制SNr的PV神经元可以有效的减少动物癫痫自发的次数，而选择性地激活SNr的PV神经元增加了动物癫痫自发的次数以及死亡率。上述结果表明SNr的PV神经元可以双向地调控颞叶癫痫的发作扩散进程。

3. SNr到丘脑束旁核（parafascicular nucleus，PF）神经环路参与调节颞叶癫痫形成

        SNr与本研究中的颞叶癫痫灶点海马之间不存在直接的投射关系，提示SNr的PV神经元可能通过其下游核团调控颞叶癫痫的形成过程。根据光遗传学病毒示踪结果显示SNr的PV神经元投射下游主要集中在丘脑核团，如丘脑网状核（reticularisnucleus，RT），丘脑腹内侧核（ventromedial thalamic nucleus，VM) ，丘脑束旁核（parafascicular nucleus，PF）以及丘脑连结核（reuniens nucleus，RE）。因此研究人员分别探索了SNr到以上四个核团的PV投射通路在颞叶癫痫形成过程中的作用，实验结果发现只有SNr-PF的PV投射通路参与了调控颞叶癫痫形成过程。在小鼠海马电点燃癫痫模型中，抑制SNr-PF的PV神经元投射通路可以减缓颞叶癫痫的形成过程；激活该通路加速颞叶癫痫的形成过程。并且在PF给予GABAA受体拮抗剂可以逆转激活SNr-PF的PV神经元投射通路的促癫痫作用。

4. SNr的PV神经元直接投射并且抑制PF的GABA能神经元

        研究人员结合使用光遗传学技术，在体/离体电生理技术以及逆向跨单突触病毒追踪的方式进一步探索SNr的PV神经元如何调控PF的神经元。首先，在在体神经元记录的实验中，研究人员使用光电极记录PF的神经元对蓝光激活SNr-PF PV投射末梢的反应，发现在PF记录到的少量GABA能神经元活动会在蓝光刺激下被抑制。其次，在离体电生理脑片记录实验中，研究人员发现PF的GABA能神经元可以被蓝光刺激诱发出GABAA受体介导的抑制性突触后电流。最后，研究人员使用逆向跨单突触病毒追踪的方式对两者之间的联系进行结构验证。使用AAV-Ef1α-DIO-GFP-TVA和AAV-Ef1α-DIO-RG及其之后的Rabies Virus (RV)-EnvA-ΔG-dsRed特异性识别PF的GABA能神经元，并且逆向追踪其上游核团，示踪结果显示SNr中发现有被逆向荧光标记的神经元，并且大部份是PV神经元。该结果提示SNr的PV神经元可以直接投射到PF的GABA能神经元。

5. PF的GABA能神经元双向调控颞叶癫痫的形成

        为了进一步探索PF的GABA能神经元是否也参与了颞叶癫痫的形成过程，研究人员进一步用光遗传学手段选择性调控PF的GABA能神经元，实验结果显示抑制PF的GABA能神经元具有加速颞叶癫痫发作扩散的过程，而特异性地激活PF的GABA能神经元可以减缓颞叶癫痫的形成过程。同时，在KA诱发的急性颞叶癫痫模型中，PF的GABA能神经元也具有类似的作用，表明PF的GABA能神经元可以双向调控颞叶癫痫的形成过程。后续研究进一步表明，PF的GABA能神经元是中间神经元，主要通过抑制PF长投射的谷氨酸能神经元参与颞叶癫痫发作。

        综上，此研究首次揭示了SNr到PF的“PV-GABA能的去抑制神经环路”参与了调控颞叶癫痫的发作扩散过程，选择性失活这条通路可以发挥显著的抗癫痫作用。这些发现补充了现有的癫痫发生是由于“兴奋-抑制失衡”传统理论，也为目前促GABA功能的抗癫痫药物产生耐药甚至加重癫痫进一步提供了新的解释。

该研究中，陈彬博士，博士后徐层林，汪仪特聘研究员，林文凯博士为共同第一作者，陈忠教授和汪仪特聘研究员为共同通讯作者。本研究得到国家自然科学基金和中国科协的项目资助。

总结

        在此项研究中，团队使用了多种枢密科技的工具病毒，AAV-EF1a-DIO-EGFP-TVA，AAV-DIO-RG 和 rabies virus RV-EnvA-ΔG-DsRed 用于逆向跨单突触追踪从SNR的PV神经元投射到PF的GABA能神经元的直接投射。
 

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-020-14648-8


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