腺相关病毒载体在心脏中的研究及应用

一、原理

        腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），病毒颗粒无包膜，结构为直径约20nm的正二十面体，是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA病毒，对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染力。通过人工进化的方法对AAV衣壳蛋白Cap基因进行定向突变改造，可以筛选到具有高转导效率和不同感染特性的AAV载体，极大增加了AAV的应用潜力。

        研究中采用的重组腺相关病毒（Recombination adeno-associated virus,rAAV）载体是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因表达载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达外源基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗。

        研究表明AAV1、AAV6、AAV8和AAV9等对心肌细胞具有较高的趋向性，可直接静脉注射感染，不需要复杂危险的开胸手术。现有的Ⅱ期临床试验，均使用AAV。利用AAV载体可实现心脏细胞广泛表达，还可以结合特异性启动子实现细胞类型的特异性表达，如需目的基因在心肌细胞中特异性表达，可使用特异性启动子，如心肌细胞特异性启动子cT.nT、心肌细胞早期特异性启动子mNkx2.5。

        rAAV所包含的DNA一般是用外源基因表达元件替换AAV的编码基因，仅保留了病毒复制和包装所需的ITR序列。通过反式补偿Rep基因、Cap基因和辅助病毒功能因子包装产生携带外源DNA的rAAV。rAAV的载体容量是4.7kb，插入外源目的片段大小不超过2.8kb。

备注：

1.血清型:同一位置选择不同注射方式，所适用的血清型会存在差异；

2.注射量:不同文献，病毒供应商不同，滴度不同，剂量会有差异；

3.以上数据大多查阅文献所得，仅供参考。

二、注射方法

        总体上包括静脉注射、心腔内注射、心肌内定（多）点注射、心包内注射（介于心肌与心包膜之间），其中静脉注射包括尾静脉注射、颈静脉注射、面部静脉注射等。最常用的方法是心肌定点注射和尾静脉注射。
 

注意事项：

        1）心腔内注射需要结合主动脉嵌夹进行，由于开胸腔手术需要辅助呼吸，对手术操作要求较高。注射体积约为20μL左右。

        2）心肌内定点注射时，使用27-29G的针头，每点注射约2-5μL，注意缓慢注射，病毒在注射的局部点附近感染较好，扩散有限。并且心脏定点注射需要开胸并辅助呼吸，对手术操作要求较高，也需要花费更长的操作时间。
        3）由于心脏血流快，或者由于病毒进入血液系统以后，肝脏的首过效应，使尾静脉注射的病毒不容易富集在心脏（反而在肝脏的富集程度更高），因此相比其他器官，尾静脉注射需要更高的病毒量。

三、应用案例

1）

        左心室前壁单次注射cT.nT启动表达Luc的5种血清型AAV载体。活体成像及荧光素酶活性测定实验显示AAV9组心脏荧光素酶活性最高。表明AAV9是目前最有效的用于直接注射转导成年小鼠心脏的血清型。
 

参考文献：

Prasad KM, Smith RS, Xu Y, French BA. J Gene Med. 2011.
 

2）

图2.测试心脏基因传递的特异启动子

        活体成像显示CMV广泛表达，荧光素酶活性测定实验进一步表示cT.NT启动基因在心脏特异表达。

图4.5种血清型AAV载体不同注射量基因表达效果

        颈静脉注射cT.nT启动表达eGFP的5种血清型AAV载体，4周后心脏冰冻切片荧光检测显示AAV9 1×10¹¹vg病毒量时eGFP在心肌细胞表达最强。

参考文献：

Prasad KM, Xu Y, Yang Z,et al. Gene Ther. 2011.

3）用于绘制小鼠心脏解剖和生理的AAV-PHP.S（眼球后静脉丛注射）

a 整个心脏：

        AAV-PHP.S（CAG-NLS-GFP），注射剂量为1×10¹²vg，4周后取材切片观察。

        结果：AAV-PHP.S比当前标准AAV9更高效靶向心脏。

b 心肌细胞

        ssAAV-PHP.S:CAG-XFPs（C57BL/6J），3个病毒的混合物，每个病毒3.3×10¹¹vg，总量是1×10¹²vg，11天后取材切片观察。

        结果：单个心肌细胞相互之间很容易区分。

c 心神经细胞

        ssAAV-PHP.S:CAG-DIO-XFPs（TRPV1-IRES-Cre小鼠），3个病毒的混合物，每个病毒1×10¹²vg，总量是3×10¹²vg，2周后取材切片观察。

d 心内神经节细胞

        ssAAV-PHP.S:Ef1α-DIO-ChR2-eYFP（ChAT-IRES-Cre小鼠），注射剂量为1×10¹²vg，3周后取材切片观察。

参考文献：

Challis RC, Ravindra Kumar S, Chan KY, et al. Nat Protoc. 2019.

4）心肌细胞中FXN-HA的高表达与琥珀酸脱氢酶（SDH）酶活性受损有关

        5周龄时MCK小鼠静脉注射AAVRh.10-CAG-hFXN-HA载体治疗，并于12周龄处死取材切片行心脏组织学观察，高表达组AAV注射量是5×1013vg/kg，hFXN-HA的表达量是10,927ng/mg，低表达组AAV注射量是2.5×1013vg/kg，hFXN-HA的表达量是695ng/mg，5周龄时注射 NaCl的12周龄野生型（WT）小鼠以及9周龄MCK小鼠均作为对照组。结果表明高表达组心脏切片中hFXN-HA表达最强的区域但SDH酶活受损。低表达组中没发现类似现象。高表达组心脏表面SDH酶活阳性量化后是73%±2%，WT NaCl组则是83%±4%。表明不到12%的整个心脏表面被影响。

参考文献：

Belbellaa B, Reutenauer L, Messaddeq N, et al. Mol Ther Methods Clin Dev. 2020.
 

5) rAAV在心脏疾病例如心力衰竭和心肌梗死治疗中的应用

        在医学领域，心力衰竭是一种难治疗的高发病率和高死亡率的疾病，而通过基因治疗来加强心肌收缩力，给晚期心力衰竭病人带来了希望。rAAV介导的肌浆网钙ATP酶2a（SERCA2a）基因疗法在临床上已经取得了较好的效果，Lyon AR等在大鼠构建心肌梗死（MI）后慢性心力衰竭（HF）模型，至少梗死16周后大鼠尾静脉注射总量为2× 10¹¹ drp（DRP：DNase resistant particles的缩写。表示能抵抗DNase1消化的病毒颗粒数）的300μL AAV9.SERCA2a，注射后4-6周取材。慢性梗死大鼠心脏心室中段10μm切片H&E染色显示梗死面积大。Western blot检测结果显示经AAV9.SERCA2a感染的HF大鼠，能够恢复心肌SERCA2a和肌集钙蛋白（CSQ）表达水平。对左心室Emax（左心室17节段最大位移）、能量效率、舒张末期P（压力）V（容积）关系（EDPVR）和左心室舒张末期压力（LVEDP）进行测量发现，HF大鼠通过SERCA2a基因传递能提高Emax，降低EDPVR、LVEDP，改善心肌能量学，表明SERCA2a基因传递至衰竭心肌细胞可降低基底Ca2+水平，并以能量有利的方式启动反向重塑，从而改善左心室功能，达到治疗心力衰竭的效果。

图1.基因传递SERCA2a能改善HF大鼠左心室功能

参考文献：

Lyon AR, Bannister ML, Collins T, et al. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011.
 

6）

        C57BL/6J未损伤小鼠尾静脉注射100μL生理盐水溶解的3.0×10¹¹GC rAAV9-CMV-Wnt11，2周后Western blot检测Wnt11蛋白表达。结果显示AAV9可以介导Wnt11实现心脏高水平蛋白表达。

图2.Wnt11在心脏中蛋白表达水平
 

        手术诱导MI前的1周，接受GFP表达小鼠骨髓移植的野生型（WT）小鼠尾静脉注射3.0×10¹¹GC编码Wnt11（rAAV9-CMV-Wnt11）或LacZ（rAAV9-CMV-LacZ）的rAAV9载体，MI8周后监测存活率。通过结扎LAD（左前降支）冠状动脉的近端部位诱发心肌梗死，从而诱发更大的梗死，通常导致相对较高的死亡率。然而，所有注射rAAV9-Wnt11的小鼠存活到第8周处死时，同一时间内内40%以上rAAV9-LacZ处理的小鼠死亡。尸检发现死亡小鼠有胸腔积液的证据，表明死亡原因是心力衰竭。

        为了确定rAAV9-Wnt11治疗是否能增强缺血性损伤后的心功能，损伤前超声心动图评估左室射血分数（LVEF）、左心室舒张末期容积（LVEDV）、每搏输出量（SV），并于心肌梗死后存活小鼠第1天和第2、4、8周重复评估。在所有每周时间点，注射rAAV9-Wnt11的小鼠LVEF、SV显著高于注射rAAV9-LacZ的小鼠，这些显著差异不能归因于rAAV9-LacZ处理组的死亡率，因为存活的rAAV9-LacZ处理小鼠在第2周和第4周的LVEF和SV均值高于随后死亡小鼠。另一方面，Wnt11的表达并没有显著改变LVEDV和左心室收缩末期容积（LVESV）。

        Wnt11基因表达对梗死面积的潜在影响通过存活至第8周的小鼠心脏切片天狼星红染色测量纤维化程度来评估。rAAV9-Wnt11治疗小鼠明显比rAAV9-LacZ处理小鼠纤维化范围小，但是两组之间差异没有达到统计学意义。然而，在非梗死区域rAAV9-Wnt11治疗后纤维化和血管周围纤维化明显低于rAAV9-LacZ处理后。因此，相当一部分与心肌恢复期间Wnt11基因表达相关的益处可归因于心脏非梗死区的改善。

参考文献：

Morishita Y, Kobayashi K, Klyachko E, et al. Sci Rep. 2016.
 

7) rAAV在心脏疾病中介导的基因编辑

        Carroll KJ等构建了带有eSpCas9（1.1）的心脏特异性转基因小鼠，通过Myh6基因的启动子（α-MHC）驱动Cas9在心肌的特异性表达。α-MHC启动子是心脏特异性转基因小鼠常用启动子。这个工具小鼠能够解决实验过程中Cas9在心脏递送和表达的难题。转基因小鼠可以维持Cas9在心脏长期高水平的表达，而这个正是CRISPR/Cas9系统在心脏部位编辑效率不高的症结所在。Cas9转基因小鼠只需要通过AAV递送sgRNA到心脏表达即可实现编辑效率的提高。

        研究中首先将U6启动子控制下靶向Myh6基因外显子3的 sgRNA与CMV驱动的ZsGreen报告基因一起克隆到AAV9骨架中，并在出生后第10天（P10）的小鼠腹腔注射1×10¹²vg的病毒，5-6周后进行分析。qPCR检测显示Cas9小鼠中AAV传递sgRNA后心脏Myh6表达显著下调（降低50%以上）。对编辑心脏结构观察显示，心脏极端扩张和肥大，心室壁变薄和心房和心室大量扩张。因此，这种方法成功得到同时发生心肌肥厚和扩张型心脏的突变小鼠。该方法可用于疾病建模，并能够快速编辑心脏中基因。

参考文献：

Carroll KJ, Makarewich CA, McAnally J, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. 2016.

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