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IF=28.77【客户文章】Nat Neurosci：浙大李晓明教授组揭示中缝背核到杏仁核的差异性投射调控焦虑状态下不同行为表现

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IF=28.77【客户文章】Nat Neurosci：浙大李晓明教授组揭示中缝背核到杏仁核的差异性投射调控焦虑状态下不同行为表现

1719 人阅读发布时间：2023-06-12 16:27

焦虑是一种对潜在威胁的情绪反应，能保护动物避免伤害并确保生存。空间回避（避开明亮区域）和社交逃避是焦虑状态的两种不同行为表征，在基础研究中，经常使用旷场实验（OFT）和高架十字迷宫（EPM）来研究小鼠的空间回避行为，常使用三箱社交实验来研究小鼠的社交逃避行为。研究表明参与焦虑行为的神经回路包括杏仁核复合体、海马和前额叶皮层之间的相互联系。然而，焦虑性刺激引起的对明亮空间的回避和社交回避是否由不同的神经环路驱动仍不清楚。
5-羟色胺（5-HT）参与情绪和社交行为的调节，选择性5-HT再摄取抑制剂是治疗大多数焦虑症的一线药物。哺乳动物中缝背核（DRN）包含大部分前脑投射5-HT神经元。DRN^5-HT神经元支配基底外侧杏仁核（BLA），特别是基底核，也称为基底杏仁核（BA）。BA主要包含谷氨酸能锥体（Pyr）神经元和异质GABA能神经元。但是，目前尚不清楚DRN^5-HT神经元是否差异支配BA中的神经元亚型，从而导致焦虑的不同行为特征。
2022年11月29日，来自浙江大学医学院的李晓明教授团队在Nature Neuroscience上发表了题为“Distinct serotonergic pathways to the amygdala underlie separable behavioral features of anxiety”的研究论文，本文中作者证明，在小鼠中，社交和焦虑性刺激分别增加和降低基底杏仁核（BA）中的5-HT水平。在中缝背核（DRN）中，5-HT∩vGluT3神经元分别投射到BA的小清蛋白（DRN^{5-HT∩vGluT3}-BA^PV）和锥体（DRN^{5-HT∩vGluT3}-BA^Pyr）神经元。激活DRN^{5-HT∩vGluT3}→BA^PV环路通过GABA_B受体作用于5-羟色胺能末梢抑制BA中5-HT释放，诱导社交回避和对明亮空间的回避。激活DRN^{5-HT∩vGluT3}→BA神经元通过5-HT1A受体（HTR1A）和5-HT1B受体（HTR1B）抑制BA^Pyr神经元的两个亚群。在BA中，HTR1A调节HTR1A⁺Pyr神经元的活性并介导对明亮空间回避，而HTR1B调节HTR1A^-Pyr神经元上谷氨酸能传递并介导社交回避。这些结果突出了从DRN到BA亚群的异质性输入在调节不同焦虑样行为中的功能意义。综上所述，本研究发现DRN不同特性的5-HT能神经元对BA的锥体神经元（Pyr）和小清蛋白（PV）阳性中间神经元的差异性投射介导小鼠的空间回避行为和社交逃避行为，并揭示不同的5-HT受体信号传递在其中的作用机制。

结果
1.社交和焦虑条件下DRN^5-HT→BA活性的变化

小鼠的焦虑状态和社交行为受到环境光照的影响，作者前期实验通过高架十字迷宫（EPM）、旷场实验（OFT）和新奇抑制摄食（NSF）测试研究不同环境光照下小鼠的空间回避行为，通过社交互动和三箱社交实验来研究不同环境光照下小鼠的社交回避行为，结果表明高强度环境光照诱导焦虑相关行为，包括避开明亮空间和社交逃避，并将300 lux环境光照作为焦虑性刺激。为记录社交或焦虑状态下BA脑区细胞外5-HT水平动态变化，研究人员利用GRAB神经递质荧光探针（GRAB5-HT2h），细胞外5-HT的量由绿色荧光蛋白（GFP）的荧光强度指示。给予小鼠社交刺激（新的同种同性）BA中GRAB5-HT2h信号在社交互动过程中增加；而给予小鼠焦虑性刺激（300 lux），BA中GRAB5-HT2h信号降低。作者进一步阐明社交或焦虑条件下DRN^5-HT神经元活性如何造成BA 5-HT信号的改变，同步检测BA中GRAB5-HT2h信号和DRN^5-HT神经元的GCaMP信号，结果显示社交条件下，社交互动过程中DRN^5-HT神经元的GCaMP信号增加，BA中GRAB5-HT2h信号也增加。然而，在焦虑条件下，DRN^5-HT神经元GCaMP信号增加，但BA中GRAB5-HT2h信号减少。

图1.社交和焦虑刺激下BA细胞外5-HT水平及DRN^5-HT神经元活性的动态变化

2.DRN^5-HT→BA神经元活性调节焦虑相关行为

焦虑条件下光遗传学激活DRN^5-HT-BA不影响EPM、OFT和NSF测试中空间回避行为；而社交互动和三箱社交实验中相比于对照组，ChR2组花费更多的时间与同种动物互动，表现出社交偏好。这些结果表明，焦虑条件下激活DRN^5-HT→BA途径促进社交互动，不影响其他焦虑样行为。另一方面，光遗传抑制DRN^5-HT-BA回路增加EPM、OFT和NSF测试中焦虑样行为，同时降低社交互动和三箱社交实验中社交能力、社交新颖性。这些结果表明，BA中5-HT的一定水平的背景释放对于维持正常的情绪状态和社交是必要的。激活DRN^5-HT→BA通路增加BA中5-HT释放和促进社交互动，而抑制DRN^5-HT→BA通路降低了BA中的5-HT并增加了焦虑相关行为，包括避开明亮空间和社交回避/损伤。然而，在焦虑条件下（~300 lux照明）DRN^5-HT-BA神经元被激活，BA 5-HT水平降低，提示DRN^5-HT神经元激活对BA中5-HT释放的潜在间接控制。考虑到BA包含各种神经元亚群，研究人员推测不同的DRN^5-HT神经元支配不同的BA神经元亚群。新闻图片3

图2.DRN^5-HT→BA神经元活性调节焦虑相关行为

3.DRN^{5-HT∩vGluT3}-BA^Pyr/PV神经元的不同特性

BA主要含有Pyr（BA^Pyr，锥体神经元）和GABA能神经元。而BA中GABA能神经元的主要类型之一是PV⁺中间神经元（BA^PV神经元）。为研究支配BA^Pyr和BA^PV神经元的DRN^5-HT神经元的特征，研究人员通过狂犬病毒逆行跨单突触系统标记BA^Pyr投射DRN神经元（DRN-BA^Pyr神经元）和BA^PV投射DRN神经元（DRN-BA^PV神经元），结果显示84.34% ± 1.49%的DRN-BA^Pyr神经元和80.01%±3.04%的DRN-BA^PV神经元为5-HT阳性且TH阴性。这些结果表明，DRN-BA^Pyr和DRN-BA^PV神经元都主要是vGluT3⁺5-HT（DRNvGluT3∩5-HT）神经元。进一步检测DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^Pyr与DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^P^V神经元的电生理特性，结果显示与DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^Pyr神经元相比，DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^PV神经元表现出相对较高的输入电阻、较高的自发放电速率和较短的半宽度。此外，近一半的DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^PV神经元表现出快速后去极化。这些结果表明DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^PV神经元本质上比DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^Pyr神经元兴奋性更高。

4.DRN^{5-HT∩vGluT3}-BA^Pyr/PV神经元调节焦虑相关行为

社交或焦虑（~300 lux刺激）条件下分别检测BA^Pyr和BA^PV神经元中的5-HT信号，利用GRAB神经递质荧光探针，结果显示BA^Pyr神经元GRAB5-HT2h信号在社交过程中增加，在焦虑刺激下降低。BA^PV神经元GRAB5-HT2h信号在焦虑刺激下而不是社交过程中增加。表明BA^Pyr和BA^PV神经元的5-HT神经支配在功能上分离。进一步检测DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^Pyr与DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^PV神经元的行为功能，利用表达光敏蛋白（ChR2）的RV逆行跨单突触系统，结果显示激活DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^Pyr神经元促进社交且不影响EPM和OFT中焦虑样行为；相反，激活DRN^{vGluT3∩5-HT}-BA^PV神经元增加了EPM和OFT中对明亮空间的回避，并减少了社交互动。总的来说，这些结果表明DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^Pyr和DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^PV通路差异调节社交和焦虑相关行为。

图3.DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^Pyr和DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^PV通路差异调节社交和焦虑相关行为

5.DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^PV神经元通过GABA_B受体抑制5-HT释放

研究人员利用单突触狂犬病毒追踪和c-Fos染色研究社交、焦虑条件下DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^PV神经元活性，结果显示非社交和社交状态下给予焦虑刺激（300 lux光照）显著增加DRN^{vGluT3∩5-HT}→BA^PV神经元c-Fos表达。随后利用光遗传、电生理记录、GRAB神经递质荧光探针等发现激活DRN^5-HT→BA^PV投射神经元，通过释放谷氨酸快速兴奋PV中间神经元；PV中间神经元通过释放GABA作用于5-HT轴突末梢的GABA_B受体，负反馈地抑制BA中5-HT的释放。

图4.PV能中间神经元通过作用GABA_B受体抑制5-HT的释放

6. DRN^5-HT-BA^Pyr投射神经元差异抑制BA^Pyr神经元亚群调控焦虑相关行为

研究人员利用单突触狂犬病毒追踪和c-Fos染色研究社交、焦虑条件下DRN^vGluT3∩⁵^-HT→BA^Pyr神经元活性，结果显示焦虑刺激不影响c-Fos表达，社交互动显著增加c-Fos表达，表明社交刺激激活了DRN^vGluT3∩⁵^-HT→BA^Pyr途径。进一步利用光遗传、电生理记录发现DRN^5-HT神经元通过5-HT受体HTR1A、HTR1B差异抑制BA^Pyr神经元亚群。进一步研究发现DRN^5-HT-BA^Pyr投射神经元可通过HTR1A受体直接抑制BA中的HTR1A⁺的Pyr；也可通过HTR1B受体间接抑制HTR1A^-的Pyr的谷氨酸能传入。最后，通过药理学和遗传学研究手段发现小鼠的空间回避行为由HTR1A介导，而社交逃避行为由HTR1B介导。

图5.BA中的HTR1A和HTR1B分别调节空间回避和社交逃避行为

结论
   本文发现DRN脑区神经元亚群特异性的5-HT能神经元调节小鼠的空间回避行为和社交逃避行为。其中一方面DRN^5-HT-BA^Pyr投射神经元通过BA脑区的5-HT1A受体调控空间回避行为，5-HT1B受体调控社交回避行为；另一方面，DRN^5-HT-BA^P^V投射神经元通过BA脑区的GABA_B受体诱导空间回避和社交回避行为。极大地拓展了当前对五羟色胺系统及杏仁核结构和功能的认识。这些发现阐明了焦虑状态下不同行为表型的神经环路和分子机制。

  浙江大学医学院李晓明教授为通讯作者，浙江大学医学院李晓明教授实验室和赖欣怡教授实验室共同培养的博士生余小丹为第一作者。该研究得到国家自然科学基金重大项目、科技创新2030重大项目-脑科学与类脑研究、国家自然科学基金面上项目、广东省重点领域研发计划、浙江省重点研发计划等资助。

  通讯作者介绍

   李晓明，医学博士，浙江大学“求是”特聘教授，教育部“长.江学者”特聘教授，中组部国家“万人计划”领军人才，博士生导师。研究方向：情感和情感障碍的机制研究。李晓明教授实验室的长远目标是通过对不同神经突触和神经环路的研究，寻求治疗神经精神疾病如焦虑、抑郁、精神分裂症等的靶分子，并提供相应的治疗策略。包括情感和情感障碍的神经环路研究；焦虑、抑郁、精神分裂症等神经精神疾病的发病机制研究。该实验室系统性地研究神经环路结构和功能的调控机制及其在神经精神疾病中的作用，研究成果发表在Nature Medicine、Nature Neuroscience、Neuron等杂志上。

本文使用的来自枢密科技的病毒产品，列表如下：

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（Reardon TR, et al. Neuron. 2016.）

枢密科技可提供RV-CVS株及SAD-B19株病毒包装服务。RV-CVS株标记特征：更低的神经毒性，更轻微的神经损伤，更高效的标记效率；感染时间延长至一个月；可结合光遗传、钙成像、Cre、Flp等技术实现脑网络特异性功能研究及基因表达调控。

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