【文献解读】综述系列 ：腺相关病毒在靶向神经系统操控中的应用

        “作为目前最常用的神经系统研究工具之一，重组腺相关病毒因其毒性小，嗜性范围广，可塑性强，目前已广泛应用于神经系统研究中。”2019年12月26日，来自于哈佛大学，MIT,冷泉港等多个实验室的成员共同在Frontiers in Neuroanatomy发表综述“Adeno-Associated Virus Technologies and Methods for Targeted Neuronal Manipulation”，系统的总结了目前腺相关病毒在神经系统中的应用方法和操作范式，包括腺相关病毒导入方式，不同血清型的优缺点对比以及病毒常规启动子和细胞类型特异性启动子的对比。

        细胞类型特异性表达的功能元件是研究神经元的活动特征的重要工具。常规的操作策略包括经典遗传组合工具如Cre/loxP和Flp/FRT等重组酶系统的使用，如特定细胞类型神经元表达重组酶的转基因小鼠与AAV病毒载体的联合应用。从而实现特定细胞类型神经元的精确靶向。良好的实验设计可以极大提高实验结果的质量，如选择合适血清型、合适启动子的病毒或者其它诸如滴度和剂量等可以影响AAV效率的因素。在本报告中，我们将讨论使用AAV和设计实验的注意事项。

        腺相关病毒实验设计中影响神经靶向的主要因素，包括:

        (A)病毒导入方法，

        (B)病毒核衣壳蛋白的类型

        (C)启动子和/或增强子驱动转基因表达，

        (D) IRES或2A元件与荧光蛋白(FP)结合的多顺反子表达

        (E) 转录后调控元件，如WPRE 或 3’UTR

        (F) 重组酶(Cre, CreER, Flp或FlpER)的表达

        转基因驱动系(通过靶向或随机整合插入基因组)以及配体依赖或重组酶依赖的表达元件，如TRE或者lox位点。

        1、如何更好地递送病毒；

        2、选择何种血清型（核衣壳蛋白）；

        3、如何很好地驱动基因表达（rAAV病毒本身或者来自于宿主细胞的驱动）

        此外，病毒的滴度和注射体积对rAAV的有效和精确导入也至关重要，但目前文献中很少提及相关细节，需要实验者花费较多时间精力以及病毒花费去摸索相关实验条件。因此，rAAV应用实验中，良好的实验设计对结果的获取，至关重要，本文主要就rAAV病毒的如下方面进行探讨。

        病毒导入路径以及血清型选择：目前常用的腺相关病毒的导入方式主要为直接注射，静脉注射以及脑脊液注射。

        直接组织注射：AAV1, AAV2, AAV5, AAV8, AAV9 以及工程化的AAV-DJ是目前常用的血清型，其中AAV2/AAV5/AAVDJ扩散相对局限，适合体积较小核团外源基因导入。rAAV的纯化方法也会影响最终病毒感染的效果，这里不展开讨论。表2中主要介绍不同血清型对病毒感染效果的影响。

        静脉注射：目前部分天然存在的AAV病毒具有跨血脑屏障的能力，相比于直接注射，跨血脑屏障病毒可以实现全脑范围的外源基因导入。目前导入效率较高的跨血脑屏障标记病毒主要包括AAV-PHPB和升级版的AAV-PHPeB,此外，外周神经系统外源基因导入的主要标记病毒为AAV-PHPS.

        脑脊液注射：主要包括鞘内注射（intrathecal injection，IT），脑室注射(intra-cerebroventricular injection，ICV)以及小脑延髓池注射（cisterna magna injection，CM）

        表1为不同病毒注射方式的优缺点对比。
 

表1  腺相关病毒导入神经系统方式对比

        目前常用的不同血清型的病毒（2/1，2/2，2/5，2/6，2/9，2/retro）均具有不同程度的逆向标记能力，其中以2/retro血清型的逆向标记能力最强。但由于retro血清型的筛选条件等原因，目前retro血清型标记在大脑新皮层等部分脑区标记效果较佳，在深部核团以及古皮层标记效果一般，并具有一定的细胞选择性，例如retro血清型对多巴胺神经元感染效果较差，但应用多巴胺神经元启动子（TH）可较好解决该问题。

        2017年，zingg.et al首次报道了高滴度的2/1型和2/9型rAAV病毒具有顺向跨突触标记的能力，突破了AAV病毒在顺向跨突触标记神经元输出环路中的应用。该跨突触应用需要rAAV病毒携带剪切酶（如cre/flp或组合）应用，顺向跨突触启动下游剪切酶依赖的病毒表达，从而实现单级下游神经元的标记和操控。但由于2/1和2/9型两种血清型病毒同时具有逆向标记的能力，因此在顺向跨突触标记中应当谨慎使用，多方面验证，使结果更具有可信度。

腺相关病毒毒性

        腺相关病毒感染后的免疫原性较低，但实际实验应用中，应当充分考虑病毒本身的因素对实验结果的影响，如病毒的滴度，体积以及表达时间。选择合适的病毒滴度和注射体积，并且控制病毒表达时间在一定范围内，可有效减少病毒过度表达或者扩散对实验结果的影响。

腺相关病毒血清型

        现有常用重组腺相关病毒主要是杂合型，即病毒包装过程中包装质粒的Rep复制基因来源于AAV2,核衣壳蛋白Cap基因来源于其他特定X亚型，所获病毒命名一般表示为AAV2/X，其中X为具体的亚型。神经科学研究中常用rAAV血清型主要包括2/1,2/2,2/5,2/8,2/9,2/DJ,2/Retro。由于capsid在病毒识别细胞表面受体上起重要作用，因此，不同的血清型的病毒偏好感染的细胞类型有较大差别。具体如表2所示

启动子

        现有腺相关病毒启动子主要包括广谱启动子和细胞类型特异性启动子，广谱启动子主要包括CMV,CAG,EF1α等，主要用于非细胞选择性/脑区特异性的神经标记。此外目前常用一些细胞类型特异性的启动子，如兴奋性神经元启动子Camk2，抑制性神经元VGat，儿茶酚胺神经元TH启动子，胶质细胞GFAP/MBP启动子等，具体如图3和图4所示。

病毒条件性表达

        重组酶系统 (基于lox位点重组，lox-site recombination, lox)，目前常用两种位点特异性重组酶系统（cre/flp），主要应用策略如下所示：

        Cre/Flp 转基因动物------AAV-DIO/FDIO-Reporter

        AAV-Promoter-Cre/Flp------AAV-DIO/FDIO-Reporter(具体promoter参考启动子部分)
 

图3 广谱启动子基本性质对比