基因沉默shRNA载体设计与构建

简介

       腺相关病毒（Adeno-associated Virus, AAV）属于细小病毒科（parvoviridae），是迄今发现的一类结构最简单且无法自主复制的线性单链DNA缺陷型病毒，对分裂的细胞和非分裂细胞均具有感染力。研究中采用的重组腺相关病毒载体（Recombination adeno-associated virus, rAAV）是在非致病的野生型AAV的基础上改造的基因载体，具有种类多样、免疫原性低、安全性高、宿主范围广、扩散能力强、体内表达基因时间长等特点，已被广泛的应用在动物水平的基因表达、基因操作和基因治疗，rAAV被视为最有前途的基因研究和基因治疗载体。

      RNA干扰（RNA interfering, RNAi）现象是由靶基因RNA序列与其互补的单链siRNA形成的RISC（RNA介导的转录沉默复合物）结合引发的广泛存在于生物体内的序列特异性基因转录后的沉默过程。由于RNAi具有高度的序列专一性，可以特异地沉默基因，从而获得基因功能丧失或基因表达量的降低。因此可以作为功能基因组学研究的一种强有力的工具。在实际应用中，通过AAV病毒载体表达shRNA进行RNAi已经非常成熟，能够有效、快捷和持久地干扰体内基因的表达。广泛应用到基因功能研究，药物靶点筛选，细胞信号传导通路分析和疾病治疗等方向。

应用

1．基因功能研究：RNAi具有高效特异性抑制基因表达的特点，运用AAV介导shRNA干扰可以调控基因表达，进而研究基因功能；

2．信号通路研究：AAV介导shRNA干扰具有宿主范围广，干扰能力强，持续时间长等特点，可以运用该技术进行体内体外相关信号通路及作用机制的研究；

3．构建疾病模型：通过AAV介导shRNA干扰可构建转基因小鼠模型；

4．基因治疗：AAV介导shRNA干扰被用于基因表达异常升高引起的疾病，如：肿瘤和病毒感染等；

5．药物开发：利用RNAi特异性高效地抑制基因的表达，获得基因功能抑制表型，进而大规模地筛选出基因靶点，从而实现短时间内药靶在细胞水平和动物水平的筛选和评定。

 

产品优势

枢密产品：

 

优势：

• 载体种类多：广谱性和特异性干扰载体全，满足您的需求；
• 安全性高：目前未发现AAV对人体有致病性；
• 免疫原性低：感染AAV的细胞，很少被免疫系统清除；
• 感染谱广：几乎所有处于分裂和非分裂的细胞均可被AAV感染；
• 扩散性强：可穿透血脑屏障，是最理想的神经元和胶质细胞感染工具；
• 高稳定性：对氯.仿等试剂有抗性；
• 特异性强：rAAV有十几种常用血清型，对不同的脏器有较高的识别及感染能力；
• 表达时间长：rAAV在组织中最长可持续表达6个月以上。

服务

服务内容

1：设计干扰序列：设计三条干扰序列或客户提供干扰序列；

2：干扰载体构建以及筛选检测；

3：rAAV干扰病毒包装与纯化；

4：滴度检测。

服务流程
 

客户提供

1：干扰的目的基因模板（质粒/菌液）或基因序列（序列/ID）；

2：病毒类型选择以及要求；

3：血清型选择。

最终交付

1：载体构建报告；

2：合同约定的rAAV病毒量；

3：rAAV质检报告。

 

案例展示

1. Lewandowski等人用AAV介导表达shRNA抑制成年大鼠的PTEN的表达，导致核糖体蛋白pS6磷酸化增加。
 

图1 成年大鼠皮质内注射AAV抑制PTEN的表达。（Lewandowski, et al.,Journal of Neuroscience, 2014）

2. Saal等人用AAV表达shRNA抑制ROCK2的表达，可减轻多巴胺能神经元在毒素诱导的帕金森病模型中的退变。
 

图2 AAV介导的shRNA体外特异性抑制ROCK2表达（Saal et al.,Neurobiology of Disease, 2015）

参考文献

1. Lewandowski, G., and Steward, O. (2014). AAVshRNA-mediated suppression of PTEN in adult rats in combination with salmon fibrin administration enables regenerative growth of corticospinal axons and enhances recovery of voluntary motor function after cervical spinal cord injury. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience 34, 9951-9962.

2. Saal K A , Koch J C , Tatenhorst L , et al. AAV.shRNA-mediated downregulation of ROCK2 attenuates degeneration of dopaminergic neurons in toxin-induced models of Parkinson"s disease in vitro and in vivo[J]. Neurobiology of Disease, 2015, 73:150-162.

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