【知识窗】AAV 血清型 1、2、5、6、8、9 在小鼠大脑的转染效率、趋向性和轴突运输分析

4635 人阅读发布时间：2023-06-14 10:51

编者按

病毒载体相比于质粒载体具有得天独厚的优势，如利用病毒天然的感染性进入细胞，感染效率高；病毒的宿主范围广，可以感染分裂细胞和非分裂细胞；病毒基因组结构简单、分子背景比较清楚，稳定易于改造、易于制备；不同的病毒载体具有不同的表达特点；通过载体改造的方式形成了复制缺陷型结构，安全性高；病毒包装技术经历了多年的研究，已趋于成熟，可用于产业化大量生产等。而腺相关病毒（AAV）载体更是病毒载体中的「明星」，因其低免疫原性，可感染多种组织细胞，可介导外源基因长期稳定表达，极低基因组整合概率，已成为最佳载体。那么，AAV 载体在使用时应该如何选择呢？这就需要了解清楚 AAV 不同血清型的表达特性，因此，小编在这里给大家推荐奥地利维也纳分子病理学研究所 Simon Rumpel 带领实验团队发表的文章「Analysis of Transduction Efficiency, Tropism and Axonal Transport of AAV Serotypes 1, 2, 5, 6, 8 and 9 in the Mouse Brain」，该文详细解析了不同血清型的 rAAV 载体在中枢系统不同脑区、不同类型细胞中的表达特点，并通过与 LPS（脂多糖）诱导的小胶质细胞激活比较发现 rAAV 载体注射后并不会引起中枢的免疫应答，同时揭示了 rAAV5 载体在内嗅皮层到齿状回兴奋性神经元投射的逆轴突运输，以及探究了双链 rAAV 载体的表达时间特性。

研究背景

病毒载体可以时空特异性的控制感兴趣的基因在各种组织中的表达，因此成为包括神经科学在内的生命科学广泛使用的研究工具。近年来，许多研究偏好利用腺相关病毒（AAV）衍生出来的重组病毒载体作为基因传递工具。与其他重组病毒相比，重组的 AAV（rAAV）具有低免疫原性和低细胞毒性，并且体内感染后可在感染细胞中长期稳定表达。

目前有 10 多种不同血清型的 AAV 可用于构建病毒载体，但是不同血清型 rAAV 载体对不同组织和不同细胞的转染效率差异较大，因此只有选对合适的血清型才能让感兴趣基因特异性表达在目标组织和细胞中。基于此，本文研究人员定量分析了 AAV1、2、5、6、8、9 在小鼠不同脑区和不同细胞中的表达特点。

实验结果

1、不同血清型的 AAV 在不同脑区与不同细胞的表达效率
研究人员将不同血清型 AAV 注射到不同脑区，21 天后通过检测绿色荧光蛋白（GFP）表达比较不同血清型在纹状体、海马和听觉皮层的表达效率。在分析的脑区中，rAAV5、8 和 9 在不同脑区的表达效率具有相似性，且显示出良好的表达水平，而 rAAV2 在所有脑区中均表达最低。rAAV 在不同脑区表达效率的排名如下：纹状体：AAV5>AAV9>AAV8>AAV1>AAV6>AAV2；海马：AAV9>AAV5>AAV8>AAV1>AAV6>AAV2；听觉皮质：AAV9>AAV8>AAV6>AAV5>AAV1>AAV2。

Figure 1、不同血清型 rAAV 在纹状体中的表达差异

为了明确不同血清型 rAAV 在不同类型细胞中的表达效率，研究人员将不同细胞的标记物和 GFP 进行共标记，定性分析发现每一种类型的 rAAV 在不同类型的细胞中均能表达。进一步量化 GFP 在不同类型细胞中的表达差异，发现 rAAV8 在海马星形胶质细胞中高表达，而 rAAV9 在皮层神经元中高表达。

Figure 2、不同血清型 rAAV 在不同细胞中的表达差异

2、不同血清型的 rAAV 都基本不引起中枢的免疫应答
当病毒感染细胞时有可能会引起免疫反应，尽管 AAV 具有低免疫原性，但是其是否会引起中枢免疫仍不清楚。研究人员与脂多糖（LPS）诱导中枢小胶质细胞激活进行比较，发现不同血清型 rAAV 基本都不会引起中枢的免疫反应。

3、rAAV5 在内嗅皮层到齿状回兴奋性神经元投射的逆轴突运输
大多数血清型 rAAV 主要感染注射位点附近的细胞，但是一些血清型 rAAV 可通过逆轴浆运输向远处转移。接着研究人员对 rAAV5 的逆轴浆运输特点进行研究。将 rAAV5 病毒注射在齿状回，通过与逆行示踪剂霍乱毒素 B（CTB）进行比较，研究人员发现 CTB 和 GFP 高度共标。进一步分析发现，GFP 特异性表达在神经元，并选择性表达在兴奋性神经元，而不与抑制性神经元共标。

Figure 3、rAAV5在内嗅皮层到齿状回兴奋性神经元投射的逆轴突运输

4、scAAV 病毒的时间表达和表达效率

天然的 AAV 病毒为单链 AAV（ssAAV），AAV 病毒表达的限速步骤是需要合成互补的双链 DNA，经过自互补形成的双链 AAV（scAAV）可明显减少病毒的表达时间。因此研究人员研究在中枢中 scAAV 表达的时间特性。发现与 ssAAV 相比，scAAV 三天就可以表达出明显的荧光蛋白，并且在注射后的 8-21 天内，scAAV 的表达效率显著高于 ssAAV。在所有检测时间点内，scAAV 的表达效率均优于 ssAAV。