【知识窗】十年里程碑-光遗传的“心”路历程！

编者按

光学工具广泛用于心脏研究已有40年的历史，在过去十年时间里，光遗传学将光学传感和光学驱动相结合，迅速整合了基因操纵技术、光学成像、电生理、钙成像、磁共振成像、信息学等学科，并由神经领域迅速拓展应用到心脏领域，成为一门多学科交叉的生物工程技术。光遗传学可以特异性的在目的细胞或者组织中表达光敏感蛋白，以高度时空特异性的方式进行精细化调控和生物功能监测。2020年刚好是心脏光遗传学发展十年的一个里程碑，因此，小编在这里给大家推荐Emilia Enycheva等人发表在《Nature Reviews. Cardiology》的文章，该综述全面评价了光遗传学在心脏毒性测试、高通量筛查等短期转化成果和光遗传学治疗心脏疾病的长期转化前景。

结合光学方法对心脏系统进行观察和干预，可精确的反馈与控制心脏的电活动。而采用光遗传学结合全光电生理学的实验手段，通过特异性兼容光遗传学调节器和光遗传学传感器，可以更精确的调节和更有效的量化心脏动力学。

1.光遗传学传感器：基因编码的钙指示剂（GECI）和基因编码的电压指示剂（GEVI）

心肌细胞胞内钙离子活性和心肌细胞膜电压能高效的评价心脏活性。GECI是能感受细胞钙离子水平变化的荧光蛋白，其接收光和发射光的性质会随着钙离子浓度的改变而变化。Cameleon蛋白是第一个开发和使用的GECI蛋白，被蓝绿光所激发。而后续研究出的GCaMP系列（由荧光蛋白、钙调蛋白和M13蛋白组成）、NIR-GECO和最.新开发的GCaMP7优化了多项动力学参数，这些GECI广泛运用于心脏成像方面的研究。

GEVI的研究要比GECI滞后许多，但目前仍有一些GEVI用于心脏方面的研究。最.先广泛使用的GEVI是VSFP2.3和ArcLight，其结构均包含磷酸酶电压传感结构域，以监控小鼠心肌细胞的电活动。最近开发的GEVI指示剂Voltron525具有高电压敏感性，指示效果灵敏度更高。此外，FlicR1、Quasars、Archon1、NIR-Butterfly均有用于细胞电活动成像。

2.光遗传学调节器：兴奋性调节器和抑制性调节器

光遗传学调节器本质上是一类光和电压敏感的蛋白，当这类蛋白表达于细胞膜上，可将光子流转化为跨膜的离子流，从而在毫秒尺度上操作细胞的膜电位。在光遗传学兴奋性调节器中，运用最广泛的是阳离子选择性的光敏感视紫红质通道蛋白（ChR2），ChR2是通道蛋白2和视黄醛结合形成，在470 nm的蓝光照射下，对阳离子通透使细胞去极化而兴奋细胞。此外，光遗传学兴奋性调节器还包括CheRiff、ReaChR和Crimson。

在光遗传学抑制性调节器中，运用最广泛的是被黄光驱动的外向氢离子泵Archaerhodopsin（Arch）。在黄光照射条件下，Arch能将胞内的阳离子泵出细胞外，使细胞处于超级化状态，从而保证细胞处于静息状态，而在没有光照的情况下，Arch能立刻恢复到关闭状态。此外，光遗传学抑制性调节器还包括PAC-K、BLINK-1、GtACR1、Halo和Jaws。

Figure 1. 光遗传学的传感器和调节器
 

1.高通量药物筛选、心脏毒性检测

药物开发的周期漫长而昂贵，从高通量筛选靶标、靶标验证，到发现目标化合物、化合物功能确认需要经历漫长的周期，而全光电生理学的使用能加速药物开发的流程。将ChR2、ArchT、QuasAr1等光遗传学工具运用于全光电生理学中，能揭露系统中电压门控离子通道的药物效应。不同频率的光刺激能诱导出不同大小的通道电流，通过加药前后对电流大小的比较能判断药物对通道的作用。

所有上市药物的临床前实验均需要检测药物对心脏的毒性。考虑到药物作用的方式、速率和时效性，在一个可控的有节奏的变化中准确捕捉心肌细胞电活性，全光电生理学是一个不错的选择。诱导人的iPSC分化为心肌细胞，并表达光遗传学制动器Cheriff和光遗传学传感器Caviar，检测药物对心脏毒性的剂量反应。在1Hz的光照频率下西沙比利对心脏毒性出现明显的剂量依赖性，显示该药物有明显的心脏毒性。

Figure 2. 光遗传学应用于高通量药物筛选和心脏毒性检测

2.人源干细胞来源的心肌细胞的检测和个性化医学

人源诱导型多功能干细胞来源的心肌细胞（iPSC-CMs）的出现改变了心脏领域的研究方式，但是由于对iPSC-CMs技术不成熟的担忧，阻碍了该技术向临床的迅速转化。而采用光遗传学工具能长期监测这些细胞表型，研究iPSC-CMs在成熟过程中的细胞变化。与传统钙染料相比，光遗传学传感器的主要优势是在长时间内进行重复测量。例如在动态监测iPSC-CMs中内向整流钾电流（Ik1）的变化，光注入产生的超级化电流与电压钳注入电流相当，提示该方法可以替代传统而费时的电压钳记录模式。

X连锁遗传病的Ogden综合征是NAA10基因的S37P发生点突变，将患者的iPSC诱导成心机细胞后，在细胞中表达ChR2并使用全光电生理学技术进行检测，发现Ogden患者诱导出来的心肌细胞存在较短的起搏点或较长的基本循环时间，相对延长了APD（动作电位持续时间），因此Ogden患者容易出现心脏问题，过早死亡。

Figure 3. 光遗传学监测iPSC-CMs的分化与个性化医疗
 

1.光遗传学可用于心律失常管理

植入式的电子起搏器、心律转复除颤器是日常心率失常管理的黄金标准，然而这些方法仍存在很大的不足，比如电压过高损伤心肌组织、设备电池寿命的限制。而光遗传学有可能解除这些缺陷，可提供一种低能量的起搏和心脏转复除颤的手段。

2.光遗传学能调节心脏起搏

光学起搏器是电子起搏器一种有效的替代方案。在小鼠心肌细胞表达ChR2后使用光遗传学对左心室（LV）进行调节，能精确调节心肌细胞的局部电活动和心脏组织的持续去极化，从而恢复心脏节律。与传统的心尖部电起搏相比，双室光学起搏传导速率更快，并且在室性心动过速（VT）过程中，光学起搏能迅速终止心动过速，恢复正常的节律。

3.光遗传学将结束心律失常

严重依赖于时空刺激的协调性是结束心律失常的最主要挑战。传统的除颤策略是一种高能耗的策略，是通过大面积心肌去极化以阻断颤波的阵面，从而阻止新的折返波的形成。而光遗传学可实现低能耗的策略，首先通过光遗传学捕捉到心律失常活动的某个阶段，然后运用定点光刺激特异性阻断颤波的阵面，可以避免高能量损伤心脏伤害性感受器，并防止骨骼肌的过度痉挛，从而实现无痛终止心律失常。

Figure 4.光遗传学用于心脏起搏和心律失常的治疗前景
 

4.光遗传学运用于心电调控和反馈调节

光遗传学可用于心脏活动的节奏管理，包括控制心肌细胞动作电位的形态，心电传导的速度和方向，并且目前有一些方案，可以实现心脏活动节奏管理的闭环调控。心肌组织中螺旋波是导致心脏猝死的重要原因，使用光遗传学调节，可以反转心肌组织中螺旋波，终止螺旋波对心脏的伤害。

Figure 5.光遗传学用于心电调控和反馈调节的前景
 

5.利用细胞特异性调节心脏功能

心脏功能不能以电流特异性的方式进行调控，药理学的手段可以提供细胞特异性的干预方式，但是时空分辨率比较低。而光遗传学技术可以提供细胞特异性的干预以及高时空分辨率。采用Cre-loxp技术在心肌细胞（MYH6启动子）特异性表达光遗传学病毒，如果大范围光照会引起心律失常，但是在容易发生心律失常的细胞进行光照则能治疗心律失常。此外心脏细胞受儿茶酚胺能神经元和胆碱能神经元的调节，选择性激活心脏中的儿茶酚胺能神经元能引起心收缩功能增加。

Figure 6.光遗传学特异性调节心脏功能的前景
 

过去十年，以心脏光遗传学为核心的基础医学研究和转化医学研究相关论文呈现爆发性的增长。虽然心脏光遗传学的治疗手段和患者依从性要优于目前的临床方法，但是心脏光遗传学从基础到临床应用的过程还有很多的挑战。例如将光遗传学相关蛋白表达于心脏会不会引起其他风险、心肌组织特异性启动子仍不够特异、血液对可见光的吸收会不会影响治疗效果等。即使有诸多的不确定性，心脏光遗传学仍是一种市场潜力巨大的心脏管理和治疗方法，对心脏光遗传学进行持续性的开发无疑为下一代心脏疗法提供重要的指导。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41569-020-00478-0

图片来源：nature reviews cardiology