【知识窗】系统注射1-9血清型AAV病毒在小鼠体内表达及靶向性研究

15250 人阅读发布时间：2023-08-07 10:09

编者按

在过去数十年的时间里，基因治疗作为一种颠覆性治疗技术，得到飞速发展，目前已有多种新药获得FDA批准上市，上千个临床实验正在实施。在各类基因治疗载体中，腺相关病毒（adeno-associated virus , AAV）载体被认为是一种最高效、最安全的基因治疗载体。腺相关病毒有多种血清型，不同血清型对组织器官的嗜性各有不同。利用腺相关病毒在不同器官进行基因表达时，选择合适的血清型非常重要，会实现更稳定高效的基因表达效果。小编在这里给大家推荐 Joseph E Rabinowitz等人发表的文章，该文总结了1-9血清型AAV病毒在小鼠体内表达的特点及靶向性，为大家日后自己的实验设计提供参考与借鉴。

目前已经鉴定出不同血清型的AAV，所有血清型的AAV均为无包膜的单链DNA病毒，都具有类似的基因组大小，相似的结构和功能。AAV血清型1-9的病毒衣壳蛋白中氨基酸的一致性为45%。然而由于病毒注射方式不同AAV病毒感染的靶器官差异也比较大，而且即便使用相同的注射方式，不同血清型的病毒感染的靶细胞也不尽相同。为了更好的研究不同血清型病毒载体的差异，应采用相同的病毒注射方式，在不同的时间点去研究载体基因的动力学特点、表达水平和器官靶向性。

首先研究人员将荧光素酶报告基因整合到不同血清型的AAV病毒中（1型到9型），然后通过尾静脉注射的方式将1-9型的AAV病毒注入小鼠体内，在注射后的第7、14、29、56、100天和9个月对小鼠进行荧光成像。随后将小鼠处死后取不同的组织器官，检测荧光素酶的表达和病毒基因组的拷贝数。

在检测荧光素酶表达活性的实验中，根据不同血清型的荧光素酶活性大致可以分为3组：低表达组（AAV2、3、4、5），中表达组（AAV1、6、8）和高表达组（AAV7、9）。注射AAV2的小鼠在100天的时候出现表达峰值，随后降低。注射AAV4和AAV5在9个月的时候出现表达峰值，而AAV3在100天的时候出现表达峰值，随后一直稳定表达。AAV1和AAV6在观察时间内一直缓慢增加，而AAV8在注射病毒后的56天出现峰值。在高表达组中，AAV7在56天出现峰值，随后一直稳定表达，而AAV9在100天达到峰值，随后表达降低。

新闻图片2

Figure 1. 不同血清型AAV病毒载体注射后荧光素酶表达活性

荧光素酶的表达分布检测实验中，在低表达组中，AAV2、3和5在腹轴上的定位模式相似，都表达在上腹部和后肢区域。然而，AAV4表达局限于胸腔。在中表达组中，AAV1和6虽然都在腹轴的胸部、腹部及后肢和背轴后躯肌表达，但是表达偏好不同。AAV1似乎偏向上腹部，而AAV6显示出对胸腔的偏好。AAV8具有独特的表达模式，表达在后肢，下腹部及上胸部。高表达组中，AAV7和9都在上腹部有很强的定位，且AAV9在全身具有更广泛的表达分布与AAV9相比，AAV7没有在上胸部和头部表达。此外，AAV9在背部后躯也有强的表达。

Figure 2. 注射不同血清型AAV病毒的荧光素酶活体成像

为了进一步分析不同AAV血清型的转导效率，作者检测了不同组织中的荧光素酶活性。在低表达组中，AAV2在肝脏组织中表达最强，这种转导水平分别是腘绳肌和心脏的26倍、30倍。AAV4主要表达于心脏，其次是肺，而AAV5表达较低，且仅局限于肝脏组织。在这组中，AAV3显示最低表达水平，主要在心脏和肝脏。在中等表达组，AAV1主要在肝脏表达，其次是心脏和后肢骨骼肌。AAV6在心脏表现出高的酶活性水平，这种转导分别比在气管肌和肝脏中观察到的水平高2.7倍和4.7倍。尽管在肺中也观察到荧光素酶蛋白表达，但其表达水平比在心脏中观察到的低约10倍。AAV8介导的荧光素酶表达主要局限于心脏，然后是腓肠肌、腘绳肌和肝脏。在高表达组中，AAV7和AAV9都主要表达于肝脏。两种血清型都在后肢骨骼肌中具有高表达。此外，AAV9在心脏中的表达高于AAV7。

新闻图片5

Figure 3. 不同血清型AAV病毒荧光素酶在各种器官的表达

实时荧光定量检测不同器官病毒基因组拷贝的试验中，低表达组病毒中，AAV3病毒的基因组拷贝数在任何组织中均不超过10⁴/μg，AAV2仅在肾脏和腓肠肌中超过10⁴个拷贝数，AAV5在脑、肾和肺中超过10⁴个拷贝数。而AAV4病毒在肾脏、脑与腓肠肌中均超过10⁴个拷贝数，在心脏中超过10⁵个拷贝数，在肺中超过10⁶个拷贝数。在中表达组病毒中，AAV1在任何组织均不超过10⁴个拷贝数，AAV6在肝和脑中超过10⁴个拷贝数，在心脏超过10⁵个拷贝数；AAV8在腓肠肌、肾脏和大脑及腘绳肌中超过10⁴个拷贝数，在肝脏和肺中超过10⁵个拷贝数。在高表达组病毒中，AAV7在肾脏、腓肠肌和睾丸及腘绳肌中表达大于10⁴个拷贝数，在肝脏中大于10⁶个拷贝数；而AAV9在除了附睾和肺以外的所有组织中均大于10⁴个拷贝数，而在心脏中超过10⁵个拷贝数，在肝脏中超过10⁶个拷贝数。